老年T2DM伴非酒精性脂肪肝病患者nesfatin-1、ADRP水平與外周單核細胞M1/M2失衡的關系

王小全

（黑龍江省佳木斯市中心醫院 消化內科，黑龍江 佳木斯 154002）

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM）是一種慢性代謝疾病，病理特征為機體處于高血糖狀態、機體相對缺乏胰島素、機體胰島素抵抗等［1］。非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）為我國最常見慢性肝臟疾病，肝細胞中脂肪大量沉積為其主要病理特征［2］。T2DM與NAFLD 因有著共同的發病因素而常并存［3］。調查［4］顯示，普通成人患病率在20%～30% 之間，T2DM 病人NAFLD 患病率在28%～70% 之間。肥胖狀態下，機體內單核細胞促炎表型（M1 型）/抗炎表型（M2 型）失衡，致使多種促炎因子產生，向各組織器官浸潤，引起組織器官損傷，導致胰島素抵抗，最終促進T2DM 與NAFLD 發病及進展［5］。因此，研究T2DM 伴NAFLD 與M1/M2 失衡的關系對于該病的臨床診治有著重要意義。人新飽食分子蛋白-1（nesfatin-1）是一種對機體攝食、能量代謝有著調節作用的脂肪細胞因子，脂肪分化相關蛋白（adipophilin,ADRP）是一種能夠調節脂質代謝的脂滴表面蛋白，兩種蛋白均與T2DM 伴NAFLD 有關［6-7］，但尚無研究報道其與患者M1/M2 失衡的關系。因此，本研究分析了老年T2DM 伴NAFLD 患者nesfatin-1、ADRP 水平與外周單核細胞M1/M2 失衡的關系，旨在探索T2DM伴NAFLD 的發病機制，為以后治療尋找新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經黑龍江省佳木斯市中心醫院醫學倫理委員會批準（批準號20180123）。選擇2019 年2 月至2021 年2 月黑龍江省佳木斯市中心醫院收治的143 例T2DM 患者，根據是否發生NAFLD 分為非NAFLD 組（n=79）和NAFLD 組（n=64）。非NAFLD 組：年齡60～85 歲，平均（71.00±5.62）歲；男51 例，女28 例；體質量指數（24.79±2.53）kg/m2；糖尿病病程2～8 年，平均（5.23±1.88）年。NAFLD 組：年 齡60～82 歲，平 均（72.26±5.39）歲；男40 例，女24 例；體質量指數（23.00±2.17）kg/m2；糖尿病病程1～9 年，平均（5.67±1.76）年。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

納入標準：①T2DM 診斷充分符合1999 年世界衛生組織（WHO）標準［8］；②NAFLD 診斷充分符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018 年更新版）》［9］；③年齡≥60 歲；④無凝血系統疾病或炎癥性腸??；⑤近期無創傷或手術等應激情況；⑥簽訂知情同意書。排除標準：①合并其他肝病，如藥物性肝病、病毒性肝病、自身免疫性肝病等；②合并各種急性或慢性感染、甲狀腺功能疾病、精神病、腦血管意外、腎功能不良、心電圖異常、結締組織病、惡性腫瘤；③病歷資料不全；④入院前接受與T2DM 伴NAFLD 有關的治療；⑤正在參與其他臨床試驗。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集及血清nesfatin-1、ADRP 水平測定 入院后記錄年齡、性別，測量所有受試者身高和體質量，計算體質量指數，采用韓國AMP 自動電子血壓計BP-705（上海聚慕醫療器械有限公司）測定收縮壓、舒張壓。所有受試者空腹10 h 以上，次日早晨抽取5 mL 靜脈血，采用Thermo Fisher Multiskan GO 全波長酶標儀（北京賽百奧科技有限公司）、nesfatin-1 試劑盒（上海心語生物科技有限公司，批號SRE-11481）、ADRP 試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號YS01785B）檢測nesfatin-1、ADRP 水平，采用全自動糖化血紅蛋白分析儀（日本TOSOH 公司）、相應試劑盒（上海富雨生物科技有限公司，批號FY-03999H1）檢測糖化血紅蛋白水平，采用PUZS-300 全自動生化分析儀（廣州市艾貝泰生物科技有限公司）、相應試劑盒（上海一研生物科技有限公司，批號EY-H97046）檢測血肌酐水平。操作步驟嚴格根據試劑盒說明書進行。

1.2.2 外周血單核細胞M1/M2 相關細胞因子mRNA 水平測定 取所有受試者外周靜脈血5 mL，用肝素鈉抗凝后經FicollPaque 梯度分離法將外周單核細胞分離出來，據TRIzol 試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，批號CD-13433-ML）說明書對總RNA 進行提取，據SuperscriptⅢ逆轉錄酶試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司，批號YT9036）說明書逆轉錄獲得cDNA。用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-PCR）法［10］對腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin 6,IL-6）、白細胞介素10（interleukin 10,IL-10）mRNA 水平進行檢測，在Bio-Rad 伯樂PCR 儀（南京貝登醫療股份有限公司）上行PCR 擴增。擴增條件：預變性（95℃、30 s），變性（95℃、5 s），退火延伸（60℃、34 s），40 個循環。擴增反應結束之后，據擴增曲線讀取循環閾值（Ct），以U6 為內參基因，通過相對定量法以2-△△Ct對TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA 水平進行相對定量分析。

1.3 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，如年齡、nesfatin-1、ADRP、體質量指數、血肌酐、糖化血紅蛋白、收縮壓、舒張壓等，組間比較采用t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，如性別等，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson 檢驗分析nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細胞M1/M2 相關細胞因子的關系；采用Logistic回歸分析T2DM 患者nesfatin-1、ADRP 水平與非酒精性脂肪肝病患病風險的關系。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料及血清nesfatin-1、ADRP 水平比較

與非NAFLD 組比較，NAFLD 組血清nesfatin-1、ADRP 水平增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組年齡、性別、體質量指數、血肌酐、糖化血紅蛋白、收縮壓、舒張壓比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料及血清nesfatin-1、ADRP 水平

2.2 兩組外周血單核細胞M1/M2 相關細胞因子mRNA 水平

與非NAFLD 組比較，NAFLD 組TNF-α、IL-6 mRNA 水平增高（P＜0.05），IL-10 mRNA 水平減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組外周血單核細胞M1/M2 相關細胞因子mRNA 水平（）

表2 兩組外周血單核細胞M1/M2 相關細胞因子mRNA 水平（）

2.3 Pearson 相關性分析

Nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細胞TNF-α、IL-6 mRNA 水平呈正相關（P＜0.05），nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細胞IL-10 mRNA 水平呈負相關（P＜0.05）。見表3。

表3 nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細胞M1/M2 相關細胞因子的關系

2.4 Logistic 回歸分析

以T2DM 伴非酒精性脂肪肝病為因變量，以年齡、性別、體質量指數、血肌酐、糖化血紅蛋白、收縮壓、舒張壓、nesfatin-1、ADRP 為自變量，進行Logistic 回歸分析，結果得出年齡、性別、體質量指數、血肌酐、糖化血紅蛋白、收縮壓、舒張壓與T2DM 伴非酒精性脂肪肝病無顯著關聯（P＞0.05），而血清nesfatin-1 高水平、血清ADRP 高水平是T2DM 伴NAFLD 的危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 T2DM 患者nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 患病風險的Logistic 回歸分析結果

3 討論

Nesfatin-1 為脂肪細胞因子之一，由82 個氨基酸組成，最初發現于下丘腦及腦干中，有減輕體質量和抑制攝食及降低血糖水平作用［11-13］。有基礎研究［14］發現，向大鼠腦室內注射nesfatin-1 后，其攝食變少，體質量降低，反之，腦室注射nesfatin-1 抗體之后大鼠的食欲顯著增加。另有研究［15］顯示，靜脈注射nesfatin-1 能夠持續性地降低高血糖小鼠的血糖水平長達6 h，進一步推測nesfatin-1 可能與機體糖脂代謝及胰島素抵抗關系密切。報道［16］提示，中樞nesfatin-1 可以通過活化InsR/IRS-1/AMPK/Akt/mTOR/TORc2 通路而改善肥胖動物模型小鼠的肝胰島素敏感性。某小樣本研究［17］顯示，2 型糖尿病患者循環血內nesfatin-1遠高于正常人，血清nesfatin-1 可能與2 型糖尿病的發生有關，并與患者胰島素抵抗有一定關系。本次研究發現，NAFLD 組血清nesfatin-1 水平較非NAFLD 組增高，通過Logistic 回歸分析發現血清nesfatin-1 高水平（O^R=3.325,95%CI=1.481～11.811）是T2DM 伴非酒精性脂肪肝病的危險因素，說明nesfatin-1 在T2DM 伴非酒精性脂肪肝病的發生中具有一定作用。

ADRP 為一種脂滴表面蛋白，由425 個氨基酸組成，50 kDa 為其分子量，分布于脂滴表面，在不同細胞中有廣泛表達，如肝細胞、肝星狀細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、外周血單核細胞等。該蛋白能夠增加胰島細胞中的脂質積聚，和胰島素抵抗、胰島素異常分泌、肝臟脂質代謝有關，是脂質積聚標志之一［18］。研究［19］顯示，缺氧可影響機體脂質代謝狀況，缺氧條件下缺氧誘導因子-2α（hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α）可通過上調ADRP 表達而促進膽固醇和脂肪酸攝取增加。資料［20］顯示，ADRP 可通過調節膽固醇調節元件結合蛋白水平而參與體內脂肪從頭合成途徑。有學者進行肝組織活檢發現非酒精性脂肪肝病患者肝臟ADRP 表達水平比正常人肝臟要高［21］。本研究結果與上述報道一致，即本次研究顯示ADRP 在伴NAFLD 的T2DM 患者中呈高表達水平，且ADRP 高水平是T2DM 伴非酒精性脂肪肝病的危險因素，進一步分析，ADRP 表達上調可能使肝細胞脂質過度積聚，從而參與T2DM 患者NAFLD 的形成。

單核細胞是巨噬細胞的前體細胞，由外周血循環系統中的骨髓髓系前體細胞分化而來，外周血單核細胞能夠一定程度地反映機體炎癥狀態。機體處于肥胖狀態下時，外周血單核細胞數量大量增加，單核細胞M1 促炎表型增高（如TNF-α、IL-6 水平上調），M2 抗炎表型減弱（如IL-10 水平下調），導致M1/M2 比例失衡，誘發機體組織器官出現損傷，引發機體發生胰島素抵抗，從而加重糖尿病病情及促使其并發癥的發生［22］。本次研究發現，與非NAFLD 組比較，NAFLD 組TNF-α、IL-6 mRNA 水平增高，IL-10 mRNA 水平減少，可能是因為T2DM 伴NAFLD 患者體內高糖和高脂水平造成單核細胞M1/M2 失衡，從而表現為促炎和抗炎因子水平異常變化。本次Pearson 檢驗分析顯示，nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細胞TNF-α、IL-6 mRNA 水平呈正相關，而與IL-10 mRNA 水平呈負相關，提示nesfatin-1、ADRP與T2DM 伴NAFLD 患者外周單核細胞M1/M2 失衡關系密切，即與患者體內慢性低度炎癥狀態相關，有望將nesfatin-1 和ADRP 作為T2DM 伴NAFLD患者抗炎治療干預的新靶點。

綜上所述，高水平nesfatin-1、ADRP 是T2DM伴非酒精性脂肪肝病的危險因素，其表達水平與外周單核細胞M1/M2 失衡有著密切相關性，有望將nesfatin-1 和ADRP 作為患者抗炎治療干預的新靶點。但其機制不明，有待進一步探索。