嵌合抗原受體-T細胞對彌漫大B細胞淋巴瘤患者Toll樣受體4、核因子κB的影響研究

路曉輝，陳香莉

（1.焦作市人民醫(yī)院，河南 焦作 454150；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003）

臨床研究結(jié)果顯示，彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）屬于最為常見的一種非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma,NHL）。其基本特點為具有較強的侵襲性，且具有高度異質(zhì)性病理特征［1］。目前條件下針對該類患者實施治療主要采取化療方式。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，40%左右的DLBCL 患者一般在接受化療治療后完全緩解，但仍有超過50%的患者對化療無任何反應(yīng)，特別是由于多藥耐藥（MDR）引起復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或者進展，從而使得預(yù)后狀況不理想［2］。近年來，過繼性免疫治療已被成功地用于惡性血液疾病的臨床治療中，尤其是基于基因改造技術(shù)表達腫瘤特異性嵌合抗原受體（CAR）-T 細胞可對腫瘤抗原進行特異性地識別，不受主要組織相容性復(fù)合體（MHC）限制的限制，對DLBCL 具有十分理想的臨床療效［3］。本研究主要探討了CAR-T 對DLBCL 患者Toll 樣受體4（toll-like receptor 4,TLR4）及核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料

選擇2017 年7 月至2020 年7 月焦作市人民醫(yī)院收治的14 例DLBCL 患者作為研究對象，均給予CAR-T 治療（觀察組）。另外選擇同期接受常規(guī)化療治療的14 例DLBCL 患者作為對照組。入選標準：①均為初診患者，且此前未接受任何放療或者化療治療；②患者組織標本均經(jīng)手術(shù)或切除活檢獲取；③均經(jīng)患者知情同意，且自愿簽署知情同意書，并對組織標本用于實驗研究工作了解；④均經(jīng)WHO 制定的相關(guān)標準［4］，且均經(jīng)醫(yī)院病理學(xué)診斷為DLBCL；⑤資料完整。排除標準：①中途退出者；②過敏體質(zhì)者；③具有精神疾病史者；④合并其他惡性腫瘤者；⑤對本研究用藥過敏者。兩組患者基礎(chǔ)資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組患者基礎(chǔ)資料比較（n=14）

1.2 研究方法

對照組采用常規(guī)化療方案進行治療，具體方法為：環(huán)磷酰胺（CTX）2～3 g/m2+依托泊苷（VP16）200 mg/m2，第1 天，粒細胞集落刺激因子（G-CSF）10 μg/（kg·d）第5 天開始，對外周血進行監(jiān)測分析，CD34+細胞＞20 個/μL 時加以采集。

觀察組采用CAR-T 進行治療。預(yù)處理方法：在CAR-T 細胞回輸前的一兩周，對患者進行預(yù)處理；預(yù)處理方案為：250 mg/（m2·d）CTX，第1 天至第3 天；25 mg/（m2·d）的氟達拉濱，第1 天至第3 天。CAR-T 細胞制備方法：①患者T細胞采集，使用血細胞分離機淋巴細胞采集流程，采集100 mL 的血細胞，經(jīng)體外分離、純化T 細胞；②體外制備CAR-T 細胞，經(jīng)①中的方法采集所得的淋巴細胞，于細胞實驗室中制備CAR-T 細胞，其具體的制備方法、制備過程、細胞數(shù)量以及質(zhì)量控制等均由該實驗室掌握。

1.3 觀察指標

1.3.1 外周血TLR4 表達量檢測方法 采用聚蔗糖密度梯度方法將外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）進行提取。細胞總RNA 采用Trizol 法進行提取，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此作為模板，開展PCR 擴增反應(yīng)。TLR4 引物均購自于上海生工生物有限公司。引物上游：5'-TACGCTAGCGACTAGCTACT-3'，下游：5'-GCGTACGTACGCTAGCGCAT-3'。擴增條件為：95℃下擴增5 min，95℃下擴增0.5 min，55℃下擴增0.5 min，72℃下擴增0.5 min，上述過程共計40 個循環(huán)。目的基因相對含量計算：RQ=2-ΔΔCt。

1.3.2 血NF-κB 的檢測方法 取患者治療前后清晨空腹狀態(tài)下肘靜脈血2.0 mL，應(yīng)用乙二胺四乙酸（EDTA）進行抗凝處理，采用淋巴細胞分離液將單核細胞予以分離；細胞核蛋白與漿蛋白抽提試劑盒，將胞漿蛋白與胞核蛋白予以提取，所有標本均于6 h 之內(nèi)完成蛋白抽提，并將其置于-80℃溫度條件下保存。NF-κB 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA 法）進行檢測，全部操作均嚴格根據(jù)試劑盒上的說明書實施。

1.3.3 檢測細胞增值 比較二代與三代CD19 CAR-T 細胞體外增殖能力：取傳代CD19 CAR-T細胞，加入培養(yǎng)液和MTT 培養(yǎng)液，放置在培養(yǎng)箱中進行孵育，孵育細胞后棄掉細胞的培養(yǎng)液后，加入二甲基亞砜（DMSO）的原液，震蕩10 min，等待所有的結(jié)晶全部得到溶液后，用酶標儀測量490 nm 處的波長，并對其OD 值進行計算。

1.3.4 療效判定 完全緩解（CR）：DLBCL 病變完全消失，并且保持1 個月以上；部分緩解（PR）：DLBCL 腫瘤病灶經(jīng)治療后最大垂直直徑乘積縮小超過50%，并且保持≥4 周；病情穩(wěn)定（SD）：DLBCL 腫瘤病灶經(jīng)治療后最大垂直直徑乘積明顯縮小＜25%，或乘積明顯增大＜25%；疾病進展（PD）：DLBCL 腫瘤病灶經(jīng)治療后最大垂直直徑乘積明顯增大＞25%，或患者產(chǎn)生新的病變。總有效率為CR 與PR 之和。比較T 淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+）的水平。

1.3.5 T 淋巴細胞亞群 統(tǒng)計兩組患者治療前后T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD4+/CD8+）的水平變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二代與三代CD19 CAR-T 細胞體外增殖能力比較

三代細胞在各培養(yǎng)時間點（0 h、24 h、48 h）細胞體外增殖能力均顯著大于二代細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 二代與三代CD19 CAR-T 細胞體外增殖能力比較（n=14,,%）

表2 二代與三代CD19 CAR-T 細胞體外增殖能力比較（n=14,,%）

2.2 兩組患者治療后臨床療效比較

觀察組患治療后，CR+PR 有效率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.094,P=0.043）。見表3。

表3 兩組患者治療療效比較（n=14）

2.3 兩組治療前后CD19+細胞百分率比較

對照組治療后3 d 及7 d CD19+細胞百分率均大于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），觀察組治療后CD19+細胞百分率均小于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且觀察組治療后3 d 及7 d CD19+細胞百分率均小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組治療前后CD19+細胞百分率比較（n=14,,%）

表4 兩組治療前后CD19+細胞百分率比較（n=14,,%）

2.4 兩組患者治療前后TLR4 與NF-κB 水平的變化情況比較

觀察組治療后3 d 及治療后7 d TLR4 與NF-κB 水平較治療前均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且觀察組治療后上述指標水平均小于對照組治療后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 兩組患者治療前后TLR4 與NF-κB 水平的變化情況比較（n=14,）

表5 兩組患者治療前后TLR4 與NF-κB 水平的變化情況比較（n=14,）

2.5 兩組患者免疫功能指標比較

治療后，觀察組的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 兩組患者免疫功能指標比較（n=14,）

表6 兩組患者免疫功能指標比較（n=14,）

3 討論

DLBCL 屬于一種大B 淋巴細胞彌散性惡性增生性疾病，其異質(zhì)性非常強［5］。DLBCL 為侵襲性淋巴瘤，發(fā)病初期不易被發(fā)現(xiàn)，且病情發(fā)展非常快，患者一旦發(fā)病，其淋巴結(jié)會迅速腫大，常合并淋巴結(jié)外疾病及骨髓侵犯等，一旦確診已為晚期，死亡率高。相關(guān)研究結(jié)果顯示：TLR 可通過從病毒與各自內(nèi)源性分子中辨識出不同的病原相關(guān)分子模式，多表達于單核細胞、巨噬細胞及樹突細胞等固有免疫系統(tǒng)細胞表面［6］。有文獻報道稱：TLR4 作為TLR 家族中的常見成員，不僅能夠廣泛地在自然殺傷細胞等免疫原性細胞表達，也在宮頸癌等惡性腫瘤細胞廣泛表達［7］。YANG等［8］研究發(fā)現(xiàn)：TLR-4 可高表達于乳腺癌細胞之中。NF-κB 蛋白因子通過與核內(nèi)增強子κB 部位之間特異性結(jié)合，以加速相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄進程，在體液免疫與腫瘤發(fā)病進程中扮演著十分重要的角色。還有研究發(fā)現(xiàn)：TLR-4 可高表達于多種淋巴瘤細胞之中［9］，然而該因子具體作用機理尚未完全明晰。NF-κB 作為TLR-4 的一種十分常見的下游分子，可高表達于淋巴瘤、肺癌以及乳腺癌細胞之中。

近些年來，隨著特異性識別B 細胞表面CD19的CAR-T 的研究及其在B 淋巴細胞血液惡性腫瘤臨床治療之中的廣泛應(yīng)用，此類疾病患者死亡率大大降低，生存率及治愈率進一步提升。本研究結(jié)果顯示：治療后觀察組患者TLR4 與NF-κB 水平較治療前顯著降低（P＜0.05）。此結(jié)果提示：CAR-T 療法對DLBCL 的臨床治療療效可能通過降低患者機體TLR4 與NF-κB 水平而得以實現(xiàn)。

周偉等［10］研究表明，免疫功能和DLBCL 病情發(fā)展息息相關(guān)，而T 淋巴細胞亞群體內(nèi)表達含量過低則會導(dǎo)致抑制或殺滅癌細胞失敗，進而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。本研究治療后，觀察組的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均高于對照組（P＜0.05），這表明CAR-T 細胞方案治療DLBCL 患者能顯著提升其T 淋巴細胞亞群水平。CAR-T 細胞方案有效治療需T細胞與DLBCL 病灶細胞直接接觸，而實體瘤中細胞浸潤于正常細胞、肌纖維間，CAR-T 細胞方案難以進入內(nèi)部。本研究采用第3代CAR-T細胞方案，其包含CD28 及4-1BB 兩共刺激信號域，具有較高的體內(nèi)增殖及存活能力，但仍有部分患者采用CAR-T 細胞方案治療無效，可推測由于CAR-T 細胞很難在機體大量擴增、細胞功能缺陷，進而導(dǎo)致治療失敗。CAR-T 細胞方案聯(lián)合檢查點抑制劑能夠明顯提高治療療效。今后，筆者將監(jiān)測CAR-T 細胞方案在體內(nèi)存活增殖情況，以進一步提高、改進CAR-T 細胞工藝、以求在其他治療方面獲得更好療效。

綜上所述，CAR-T 治療DLBCL 短期臨床療效較為顯著，可有效降低患者機體TLR4 與NF-κB 水平。