基于SARS-CoV-2 關鍵蛋白ACE2 探索“葛根-柴胡”治療COVID-19 的潛在機制

張維芯，周 青，戴國梁，鄒建東，寇建秋

江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029

世界衛生組織對此次新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情在全球的風險評估為：非常高。通過全基因組比對，郝沛等［1］發現，SARS-CoV-2是通過S-蛋白與人血管緊張素轉化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）互作的分子機制感染人呼吸道上皮細胞。JAMES DIAZ［2］也證明 了ACE2 通過SARS-CoV-2 進入宿主細胞的表面受體，是病毒能否成功感染的關鍵因子。

目前，中草藥憑借其“多有效成分-多作用靶點-多信號通路”的特性較西藥的“直線-單靶點”特性，在多種病毒性疾病的治療中占有一定優勢。本研究以SARS-CoV-2 感染過程關鍵靶蛋白ACE2為靶點，通過網絡藥理學方法進行中藥及其單體化合物的篩選；并從主治癥候群、配伍角度，多層次、多角度探討中草藥治療COVID-19 的相關機制及潛在可能性，希望為后期藥物研發及COVID-19的治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 ACE2 三維結構確定與疾病相關蛋白分子作用構建基于建勛課題組解析SARS-CoV-2 S 蛋白RBD 端與人細胞受體ACE2 蛋白復合體2.5 分辨率晶體結構、青島海洋科學與技術試點國家實驗室（http://ncovtarget.qnlm.ac/web/mg/hm）提供的COVID-19 藥物靶標結構信息共享平臺系統，以及美國國立衛生研究院（NIH）和德州大學奧斯汀分校（UT Austin）研究成果，構建ACE2 三維結構（圖1）［3-4］。將其帶入在線網站String 11.0（https//string-db.org），分別從生物化學、信號轉導和遺傳網絡角度研究ACE2 蛋白與疾病相關蛋白分子間的關系。

圖1 ACE2三維結構

1.2 “葛根-柴胡”作用靶點獲取

1.2.1 “葛根-柴胡”活性成分及靶標蛋白篩選借助中藥系統藥理學分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以“ACE2”為關鍵詞，搜索作用于ACE2的中草藥及活性成分（圖2）。結合COVID-19的臨床特征［5］——發熱，選擇具有解肌退熱、和解少陽的“葛根-柴胡”作為潛在藥物。以口服生物利用度（OB）≥24%，生物活性分子的類藥性（DL）≥0.20 作為“柴胡-葛根”活性成分篩選標準，并得到相關標靶蛋白。

圖2 作用于ACE2的中草藥及其活性成分

1.2.2 “葛根-柴胡”活性成分-靶標蛋白網絡可視化構建借助Uniprot（https://www.uniprot.org）、PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）和GeneCards（https://www.genecards.org/）在線數據庫，根據活性成分和靶標蛋白的中心度值（Betweenness Centrality）、親中心度（Closeness Centrality）、度值（degree）查詢“葛根-柴胡”活性成分靶標蛋白對應基因名，使用Cytoscape 3.7.2（http://www.cytoscape.org/）軟件構建活性成分-靶標蛋白網絡，進行“葛根-柴胡”活性成分-靶標蛋白網絡可視化構建。

1.2.3 “葛根-柴胡”活性成分靶點通路可視化分析將“葛根-柴胡”活性成分作用靶點導入DAVID 6.7（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，將所有靶基因名稱校正為官方名稱（official gene symbol），進行GO（Gene Ontology）生物學過程富集分析；設定閾值P＜0.05，進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路富集分析；使用在線繪圖網站Omishare Tools（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）將結果可視化。

1.2.4 “葛根-柴胡”活性成分-ACE2 靶點分子對接依據青島海洋科學與技術試點國家實驗室共享的COVID-19 藥物靶標，選取其中Spike-RBD，ACE2 蛋白和Mpro 蛋白，采用Swiss-Model 同源模建方法，經力場限制性優化后的分子結構，將“葛根-柴胡”活性成分的分子結構導入Chem3D 獲取其3D 結構，進行去氫離子化并使其能量最小化。使用Ledock（http://www.lephar.com/）進行小分子與蛋白對接，取打分最高的構想運用PyMOL 2.3.0分析并作圖。

1.3 “葛根-柴胡”臨床數據篩選參考《中醫方劑大辭典》，檢索以“葛根”“柴胡”為君藥治療外感、溫病、瘟疫的中醫方劑，建立方劑數據庫，運用SPSS Modeler 14.1 網絡模型，統計上述方劑主治的臨床證候及中草藥配伍關系。

2 結果

2.1 “葛根-柴胡”活性成分通過TCMSP檢索到“葛根-柴胡”活性成分367個，其中18個來自葛根，349個來自柴胡。以OB≥24%、DL≥0.20篩選出活性成分28個，其中5個來源葛根，23個來源柴胡。見表1。

表1 “葛根-柴胡”活性成分基本信息

2.2 “葛根-柴胡”活性成分-靶點互作網絡“葛根-柴胡”活性成分-靶點網絡共包含270個節點（19個化合物節點、251個靶點節點）和527條邊，平均每個活性成分與27.7個靶點相互作用，每個靶點平均與2.1個活性成分相互作用；其中52.6%的活性成分作用靶點≥12個，其中靶點≥30個的活性成分有7個，排名前5 位的活性成分分別是槲皮素quercetin MOL000098、葛根素puerarin MOL012297、山柰酚kaempferol MOL000422、芒柄花黃素formononetin MOL000392、β-谷甾醇beta-sitosterol MOL000358，分別能與147、103、60、37、36個靶點蛋白發生相互作用；從靶點角度，排名前5位的是PTGS2、PPARG、PTGS1、AR、NOS2，分別能與11、10、10、9、9個化合物發生相互作用。方形代表葛根中化合物，六邊形代表柴胡中化合物，圓形代表靶點，每條邊表示活性成分與靶點之間的相互作用關系。見圖3。

圖3 葛根-柴胡藥對中化合物-靶點網絡

2.3 “葛根-柴胡”活性成分與ACE2蛋白的核心網絡(PPICN)構建將ACE2帶入String 11.0進行分析，得出ACE2的PPICN，得到ACE2的直接/間接作用蛋白共11個。通過在線韋恩圖求得“葛根-柴胡”活性成分作用靶點與ACE2的交集基因共3個，分別為DPP4、ACE2、AGTR1。見圖4—5、表2。

表2 “葛根-柴胡”活性成分與ACE2直接/間接作用蛋白的交集基因

圖4 ACE2蛋白相互作用核心網絡（PPICN）

2.4 “葛根-柴胡”活性成分靶點通路分析DAVID中GO功能富集分析得到GO條目2097個（P＜0.05），其中生物過程（BP）條目1684個，細胞組成（CC）條目116個，分子功能（MF）條目297個，生物過程、細胞成分和分子功能分別占80.31%、14.16%和5.53%。KEGG通路富集篩選得到25條信號通路（P＜0.05），涉及非小細胞肺癌和小細胞肺癌信號通路等，其中非小細胞肺癌通路涉及PRKCA-E2F1-EGFR-PIK3CGE2F2-RXRA-ERBB2-TP53-AF1-RB1-BAD-PRKCB-AKT1-MAPK1-CCND1-CASP9-RASSF1-EGF；小細胞肺癌通路涉及E2F1-PIK3CG-E2F2-PTGS2-RXRA-RELA-TP53-NFKBIA-RB1-BCL2L1-CDK2-AKT1-CCND1-CDKN1BCASP9-BCL2-NOS2-IKBKB-MYC-CHUK（圖6—7）。

圖6 “葛根-柴胡”活性成分作用靶點KEGG富集分析

圖5 與ACE2直接/間接作用蛋白的交集基因

圖7 “葛根-柴胡”活性成分靶標GO富集分析

2.5 “葛根-柴胡”活性成分與Spike-RBD、ACE2和Mpro分子對接結果將“葛根-柴胡”排名前5位的化合物槲皮素、葛根素、山奈酚、芒柄花黃素和β-谷甾醇化合物離子化單體與Spike-RBD、ACE2和Mpro進行分子對接，結果顯示葛根素與Spike-RBD、ACE2的結合性最好，槲皮素與Mpro的結合性最好。見表3及圖8—9。

圖8 槲皮素、葛根素、山柰酚、芒柄花黃素和β-谷甾醇化合物離子化

表3 槲皮素、葛根素、山柰酚、芒柄花黃素和β-谷甾醇作用于Spike-RBD、ACE2和Mpro的結合效能

圖9 “葛根-柴胡”活性成分與Spike-RBD、ACE2和Mpro的分子對接結果

2.6 “葛根-柴胡”方劑數據挖掘結果共收錄“葛根”“柴胡”治療外感、溫病、瘟疫、疫病的方劑110首，涉及方書44本，其臨床癥候包括惡寒、發熱、骨節疼痛、心煩、口渴、項強等，惡寒、頭痛、身熱頻次最高；臨床配伍中，與“葛根-柴胡”配伍頻次最高的其他藥物為生石膏、黃芩、知母、甘草。見表4及圖10—11。

圖10 “葛根-柴胡”主治癥候群

表4 “葛根-柴胡”方劑涉及方書基本信息

圖11 “葛根-柴胡”藥物核心配伍

3 討論

疫病是指感受疫癘之氣造成的一時一地大規模流行的急性傳染病總稱，又稱瘟疫［6］。東漢時期張仲景在《傷寒雜病論》自序中稱：“余宗族素多，向余二百，建安紀年以來猶未十稔，其死亡者，三分有二，傷寒十居其七。”從70%的死亡率看，疫病流行在當時相當猖獗。元代王履《醫經溯洄集》中指出［7］，瘟疫，乃感天地惡毒異氣；治療原則吸取劉河間清熱瀉火思想，主張溫病“治以辛涼占寒”，其疾病的轉機為“熱自內達外”。明代龔廷賢《壽世保元》中云：“瘟疫之病，皆是大熱之癥，不町妄用熱藥。”［8］明代吳又可《溫疫論》中指出［9］：“夫瘟疫之為病，非風、非寒、非暑、非濕，乃天地間別有一種異氣所感。”強調需進行病因治療，提出了“一病只須一藥之治”的設想，為傳染病的專病專治開創了思路。COVID-19 屬中醫“疫病”范疇［10-12］，其主癥為：發熱、乏力、咳嗽；病位在半表半里之間；對于以發熱為主癥的，國醫大師熊繼柏推薦輕清宣透療法，如小柴胡湯或者小柴胡湯合桑菊飲。

最新基礎研究數據表明，ACE2 是COVID-19 病毒S 蛋白的細胞受體；COVID-19 的S 蛋白可能通過結合細胞受體ACE2 引導病毒進入宿主細胞，且冠狀病毒RBD 端與ACE2 的結合親和力越高，病毒的感染性和致病性越強。SARS-CoV-2 感染患者出現多臟器損傷，推測其機制可能為SARS-CoV-2結合ACE2，下調ACE2 的表達，使ACE-Ang Ⅱ軸和ACE2-Ang-（1-7）軸平衡失調，促炎因子表達升高，誘發炎癥風暴，導致全身炎癥反應［13］。據中國中醫研究院吳文清對中國疫病的統計［14］，從西漢到清末，中國至少發生過321 次大型瘟疫，在有限的時間和區域內，中醫藥一次又一次與各種疫病展開了生死對決，并控制了疫情蔓延。TANG S 等［15］在Lancet 雜志上發表文章指出，中醫藥在控制疫情大規模爆發方面具有重要作用。

本研究基于青島海洋科學與技術試點國家實驗室提供的COVID-19 藥物靶標信息，針對SARSCoV-2感染過程關鍵靶蛋白ACE2進行中草藥及其有效活性成分的篩選，并基于中醫經典醫籍，分別從網絡藥理學、經典醫籍方面，多層次、多維度對“葛根-柴胡”治療COVID-19 進行了探索性研究。網絡藥理學研究顯示，“葛根-柴胡”藥對較高的活性成分均可作用于ACE2，分子對接結果顯示槲皮素、葛根素與ACE2 的結合能力高于洛匹那韋和利托那韋，同時槲皮素、葛根素、山柰酚與Mpro 結合能力也高于洛匹那韋和利托那韋。通過對經典醫籍的數據整理，我們可以看出“葛根-柴胡”治療外感、溫病、疫病的最主要癥候為：惡寒、身熱、頭痛。溯源文獻，明代《本草正》［16］：葛根，其性涼散，其氣輕，善達諸陽經，且以陽明為最，善解表發汗，善解溫熱時行疫疾，凡熱而兼渴者，此為最良，當以為君，而佐以柴。《本草正》：柴胡，其性涼，其性散，味微苦，屬足少陽膽經藥，治寒熱往來，療瘧疾，除潮熱，為和解要劑。“葛根-柴胡”藥對具有確切的解肌退熱、和解少陽功效，與目前報道的SARS-CoV-2 臨床癥狀較為吻合，具有潛在的治療COVID-19功效，為深層次探索中醫藥治療COVID-19 提供了依據。