新型齊墩果酸衍生物的設計、合成及生物活性研究

張蓬勃，宋艷玲

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA，圖1)又稱土當歸酸、四慶素，是天然分布十分廣泛的五環三萜類化合物，在齊墩果、青葉膽、獐牙菜、大星芹、女貞子、大籽雪膽、楤木中以糖苷或游離態的形式存在.齊墩果酸是一種極具研究價值的天然產物，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗微生物等.但由于齊墩果酸母核剛性較強、骨架可塑性較低、且本身水溶性較差等原因，導致齊墩果酸的生物利用性較差，較大劑量服用會導致膽囊水腫.故對齊墩果酸母核進行結構修飾，通過引入具有一定生物活性的化學片段，以期提高生物活性，增強藥理作用[1-5].

人腦多形性膠質母細胞瘤是成人常見的中樞神經系統惡性神經上皮性腫瘤，嚴重影響著人類的健康生活.Narciclasine(圖1)對人腦多形性膠質母細胞瘤具有較強抑制作用，IC50值為50 nmol/L.1mg/kg劑量的Narciclasine能明顯提升GL19多形性膠質母細胞瘤小鼠的存活率(存活率P=0.002)，其作用機制可能是通過激活多形性膠質母細胞瘤細胞中的Rho蛋白和應力纖維[6-7].構效關系研究表明，其結構中的內酰胺環是產生抗腫瘤活性的重要藥效基團.因此,對齊墩果酸母核A環進行結構改造，通過A環擴環并引入內酰胺片段，設計并合成新型齊墩果酸衍生物.

圖1 齊墩果酸及Narciclasine化學結構式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-600型核磁共振儀,美國Bruker公司；Büchi B-540熔點測定儀,瑞士Büchi公司；薄層色譜(GF-254)、柱色譜硅膠(200～300目),青島海洋化工有限公司；齊墩果酸(質量分數98%),陜西慈緣生物技術有限公司；氟硼酸鋅水合物,上海易恩化學技術有限公司；鹵代烷烴類藥品,上海麥克林化學試劑有限公司；其他溶劑和藥品均為分析純.

1.2 合成實驗

OA衍生物的合成路線見圖2.以齊墩果酸為原料，將C-3位羥基氧化為羰基生成化合物1，再通過C-3位羥肟化得到化合物2，化合物2通過貝克曼重排反應得到化合物3，再通過C-28位酯化反應得到目標化合物.

a Jone試劑,丙酮,異丙醇,0 ℃ b 鹽酸羥胺,吡啶,50 ℃ c 氟硼酸鋅水合物,乙腈,100 ℃ d 碳酸鉀,鹵代烷,N,N-二甲基甲酰胺,室溫

1.2.1 3-羰基-齊墩果酸(1)的制備

將齊墩果酸1.000 g、2.189 mmol溶于50 mL無水丙酮溶液中，冰浴條件下緩慢滴加Jones試劑2.5 mL，滴加完畢后撤除冰浴，室溫下反應3 h，TLC監測反應.反應完畢，加入60 mL異丙醇淬滅.反應結束后，減壓除去溶劑，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干，無水乙醇重結晶，得白色晶體化合物(1) 0.86 g，產率為86.45%，mp 186～187 ℃(文獻mp 185～186 ℃)[8].

1.2.2 3-羥肟基-齊墩果酸(2)的制備

將3-羰基-齊墩果酸(0.800 g，1.761 mmol)溶于20 mL無水吡啶溶液中，加入鹽酸羥胺(0.551 g，7.924 mmol)，50 ℃油浴條件下反應4 h，TLC監測反應.反應結束后加入適量二氯甲烷溶液稀釋，用體積分數為10%的鹽酸洗滌3次，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物(2) 0.668 g，產率為80.75%，mp 236～238 ℃.

1.2.3 化合物3的制備

將3-羥肟基-齊墩果酸(0.500 g，1.064 mmol)溶于20 mL無水乙腈溶液中，加入氟硼酸鋅水合物(0.025 g，0.106 mmol)，100 ℃下回流反應3 h，TLC監測反應.反應結束后加入適量二氯甲烷稀釋，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物(3) 0.258 g，產率為51.60%，mp 228～231 ℃.

1.2.4 化合物Ⅰ1的制備

將化合物3(0.150 g，0.319 mmol)和無水碳酸鉀(0.110 g，0.798 mmol)溶于20 mL干燥的DMF溶液中，攪拌下緩慢加入碘甲烷(0.091 g，0.638 mmol)，室溫下繼續攪拌反應2 h，TLC監測反應.反應結束后加水稀釋，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干溶劑，硅膠柱層析分離(200～300目)，洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯，得到白色固體產物化合物(Ⅰ1)0.107g，產率為66.49%，mp 252～255 ℃.1H-NMR(600 MHz,DMSO),δ:7.55(s,1H,CONH),5.29(s,1H,H-12),3.63(s,3H,CH3),1.52(s,3H,CH3),1.50(s,3H,CH3),0.97(s,3H,CH3),0.92(s,3H,CH3),0.91(s,3H,CH3),0.82(s,3H,CH3),0.80(s,3H,CH3).

1.2.5 化合物Ⅰ2的制備

將化合物3(0.150 g，0.319 mmol)和無水碳酸鉀(0.110 g，0.798 mmol)溶于20 mL干燥的DMF溶液中，攪拌下緩慢加入溴乙烷(0.069 g，0.638 mmol)，室溫下繼續攪拌反應2 h，TLC監測反應.反應結束后加水稀釋，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干溶劑，硅膠柱層析分離(200～300目)，洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯,得到白色固體產物化合物(Ⅰ2) 0.103 g，產率為64.86%，mp 258～259 ℃.1H-NMR(600 MHz,DMSO)，δ:7.58(s,1H,CONH),5.25(s,1H,H-12),4.28(m,2H,—CH2),1.52(s,3H,CH3),1.51(s,3H,CH3),1.27(s,3H,CH3),0.98(s,3H,CH3),0.92(s,3H,CH3),0.91(s,3H,CH3),0.83(s,3H,CH3),0.80(s,3H,CH3).

1.2.6 化合物Ⅰ3的制備

將化合物3(0.150 g，0.319 mmol)和無水碳酸鉀(0.110 g，0.798 mmol)溶于20 mL干燥的DMF溶液中，攪拌下緩慢加入溴丙烷(0.078 g，0.638 mmol)，室溫下繼續攪拌反應2 h，TLC監測反應.反應結束后加水稀釋，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干溶劑，硅膠柱層析分離(200～300目)，洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯，得到白色固體產物化合物(Ⅰ3) 0.982 g，產率為60.15%，mp 280～283 ℃.1H-NMR(600 MHz,DMSO)，δ:7.57(s,1H,CONH),5.28(s,1H,H-12),4.21(m,2H,—CH2),1.78(m,3H,—CH2),1.52(s,3H,CH3),1.50(s,3H,CH3),1.08(s,3H,CH3),0.97(s,3H,CH3),0.93(s,3H,CH3),0.91(s,3H,CH3),0.82(s,3H,CH3),0.80(s,3H,CH3).

1.3 抗腫瘤活性實驗

以Narciclasine為陽性對照藥，取對數生長期的人腦多形性膠質母細胞瘤細胞(BT-325)和人肝癌細胞(HepG2)，以每孔5×103個接種于96孔板內，每組3個復孔，CO2培養箱中培養24 h后備用.待細胞貼壁后，分別加入待測化合物，藥品濃度為10 μmol/L，空白組為陰性對照組，Narciclasine為陽性對照組.培養箱中繼續培養72 h.加入MTT溶液(5 g/L，20 μL)，繼續培養4 h，吸去每孔上清液，加入二甲基亞砜200 μL，震蕩器上震蕩5 min，然后用酶標儀于570 nm處測OD值，重復3次實驗，取平均值，計算所測化合物對腫瘤細胞的抑制率.使用Gragphpad軟件計算IC50值.

2 結果與討論

目標化合物Ⅰ1～Ⅰ3、OA和Narciclasine對人腦多形性膠質母細胞瘤細胞(BT-325)和人肝癌細胞(HepG2)抑制率和半數抑制濃度(IC50)值見表1.

表1 化合物對BT-325和HepG2細胞株的抗腫瘤活性

體外抗腫瘤活性測試結果表明：目標化合物Ⅰ1—Ⅰ3對BT-325和HepG2兩種腫瘤細胞株都體現出了一定的生長抑制作用，均高于先導化合物齊墩果酸.其中化合物Ⅰ1對BT-325細胞的抑制活性最好(抑制率=50.3%，IC50=17.1 μmol/L).通過初步構效關系研究表明：隨著C-28位酯基取代基碳鏈的延長，化合物對BT-325和HepG2細胞的抑制活性降低.這是因為隨著碳鏈延長，可能使化合物空間位阻增大，從而影響其生物活性.

在目標化合物的合成過程中，對化合物3的合成反應條件進行優化與改進.在非均相鋅催化體系下進行酮和鹽酸羥胺的貝克曼重排反應[9-11].與傳統高溫和強酸條件下的貝克曼重排反應相比，反應操作簡單，反應選擇性高，收率高、反應廢液少，反應原子經濟性較高，符合綠色化學要求.同時考查反應溫度和反應時間對收率的影響.按照不同的反應溫度(90℃，100℃，110℃和120℃)進行實驗，通過TLC監測反應終點，考察溫度對反應時間與反應收率的影響：當反應溫度為90 ℃時，反應時間6 h，TLC監測反應完全，收率為50%;當反應溫度為100 ℃時，反應時間3 h，TLC監測反應完全，收率為60%;當反應溫度為100～110 ℃時，收率未見提高.因此,反應最適溫度為100 ℃.考查反應溫度100 ℃下反應時間對收率的影響，反應時間2 h時，反應未完全，反應時間為3 h，反應完全，繼續延長反應時間，反應產率降低.結果表明反應時間過長，可能造成部分產物分解，降低反應產率.

3 結 論

設計并合成了3個新型齊墩果酸衍生物.體外腫瘤細胞抑制活性測試結果表明:目標化合物對BT-325和HepG2腫瘤細胞均有明顯的生長抑制作用，均優于先導化合物OA.構效關系表明:將齊墩果酸A環改造為七元內酰胺環能顯著提高其抗腫瘤活性.本研究結果對齊墩果酸衍生物的進一步優化設計具有一定的參考意義.