滇龍膽草對博萊霉素誘導小鼠肺纖維化的干預作用

皮娜 朱振東 何琴 鐘燕 靳璇 張旋

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是由各種肺內外致病因素所致的慢性、進展性、致死性的間質性肺疾病，可導致患者肺功能不可逆下降、進行性呼吸衰竭，甚至死亡，其治療困難，預后差，嚴重危害人類健康[1,2]。因此，肺纖維化也被俗稱為不是癌癥的癌癥。同時，肺纖維化也是發生肺癌的一個重要危險因素，肺纖維化患者繼發肺癌的比例遠遠高于普通人群[3]。因此，對于肺纖維化患者，如何延緩或逆轉肺纖維化進程，最大限度地改善肺功能一直是醫學界的一個難題。2014年，美國FDA同時批準了兩個治療特發性肺纖維化的新藥：吡非尼酮和尼達尼布[4]。然而，這兩種新藥長期服用會引起一系列不良反應如肝功能損害，而且價格昂貴，普通患者難以承受。因此研發高效、低毒、經濟的抗肺纖維化新藥十分必要。滇龍膽草(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)為龍膽科龍膽屬植物，也被稱為堅龍膽、苦膽草、小秦艽，為云南道地中藥材，主產于云南，在四川、貴州、廣西、湖南等地也有分布[5]。滇龍膽草主要以根及根莖入藥，味苦、性寒，歸肝、膽經。目前滇龍膽草已被《中國藥典》收錄，作為傳統中藥材龍膽的重要基源植物。研究表明，從該屬植物中分離出的主要生物活性成分為環烯醚萜、黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性，此外，源于該植物的天然產物沒有明顯的動物毒性、細胞毒性和基因毒性[6]。在抗纖維化方面，研究發現來源于該植物的苦膽草能改善大鼠肝纖維化程度，對大鼠肺纖維化也有保護作用[7,8]，但作用機制尚不明確。本研究在博萊霉素制備小鼠肺纖維化模型上進一步觀察滇龍膽草的抗肺纖維化作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級雄性昆明種小鼠120只，5～7周齡，體重18～22 g，由昆明醫科大學實驗動物學部提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(滇)2020-0004。

1.1.2 藥物與試劑:滇龍膽草購自昆明市螺螄灣中藥材市場，并經昆明醫科大學藥學院陸露教授鑒定為滇龍膽，樣本編號：20200625；吡非尼酮(PFD)，生產批號：J1001A，購自大連美侖生物技術有限公司；注射用鹽酸博萊霉素(BLM)，生產批號：19012311，購自海正輝瑞制藥有限公司；蘇木精-伊紅染色液，生產批號：190815，購自廈門邁威生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，生產批號：090119191205，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒，生產批號：071820200727，購于碧云天；Masson三色染色試劑盒，生產批號：1911278004，購自福州邁新生物技術有限公司；羥脯氨酸試劑盒(堿水解法)，生產批號：20200722，購自南京建成生物工程研究所；α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，生產批號：QR3252482-10，購自美國Abcom公司 ；GAPDH Rabit Polyclonal antibody，生產批號：10494-1-AP，HRP-偶聯Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，生產批號：20000243，購自美國 Proteintech公司；Bio-rad Clarity Western ECL化學發光底物，生產批號：170-5060，購自美國Bio-rad公司；彩虹180廣譜蛋白Marker(11-180 KDa)，生產批號：828A021，購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理:小鼠適應性飼養1周開始實驗。將小鼠隨機分為正常對照組(NS)，模型組(BLM)，吡非尼酮組(PFD)，滇龍膽草低、中、高劑量組(Gen50、Gen100、Gen200)，每組20只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，暴露氣管，正常對照組一次性氣管內滴注無菌0.9%氯化鈉溶液，其余各組一次性氣管內滴注博萊霉素5 mg/kg，滴注后立即將小鼠直立旋轉，使博萊霉素溶液或0.9%氯化鈉溶液均勻分布于肺內。從造模當天開始，滇龍膽草低、中、高劑量組分別灌胃給予50、100、200 mg/kg滇龍膽草0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每日給藥1次；對照組和模型組小鼠灌胃給予相應體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；吡非尼酮組組灌胃給予50 mg/kg吡非尼酮。在給藥第14天和第28天，分別麻醉處死每組10只小鼠，收集肺組織標本，進行HE染色、Masson染色、羥脯氨酸(Hyp)檢測及Western blot檢測。

1.2.2 小鼠行為學觀察及體重測量:觀察小鼠呼吸、活動及飲食情況，毛發顏色變化。在造模給藥第1天稱體重，之后每周稱一次體重，記錄數據。

1.2.3 肺系數:小鼠麻醉處死后，分離肺組織，稱量肺臟重量。根據小鼠體重和肺臟重量計算各組小鼠肺系數。肺系數=肺臟重量(mg)/體重(g)×100%。

1.2.4 Hyp含量測定:取每組小鼠右上肺采用堿水解法操作，根據試劑盒說明將組織放入試管中并加入水解液1 ml，沸水浴水解20 min，加指示劑10 μl，調整pH值至6.0～6.8，加雙蒸水定容至10 ml并混勻，取3 ml水解液加入活性炭20 mg，3 500 r/min離心10 min，取上清液1 ml按照試劑盒操作加入對應試劑，混勻，水浴離心后取上清于550 nm處做吸光度(A)值檢測。

1.2.5 Western blot檢測肺組織α-SMA蛋白表達:取小鼠肺組織100 mg，剪碎勻漿，加入蛋白裂解液裂解，收集上清液，采用BCA 定量蛋白試劑盒進行蛋白定量檢測。取20 μg蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白組分后，轉印蛋白于PVDF膜上。α-SMA(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 500)一抗4℃過夜，TBST漂洗。加入山羊抗兔 IgG-HRP 二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h，TBST漂洗，ECL液顯影。以GAPDH為內參蛋白，以目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比定量分析蛋白相對表達水平。

1.2.6 病理組織學觀察:肉眼觀察肺組織大體病理改變，然后取小鼠左肺，用10%中性甲醛固定液固定24 h 后，由低濃度到高濃度酒精梯度分別脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋組織，蠟塊室溫冷卻后以5 μm厚度切片行常規HE染色和Masson染色，顯微鏡下分別觀察肺組織炎癥程度和膠原纖維沉積情況，參照Szapiel等[9]的方法對肺泡炎進行評分，參照Fulmer等[10]的方法對肺間質纖維化程度進行評分。

2 結果

2.1 一般情況 對照組小鼠飲食狀況良好、毛發光澤發亮、活動正常、呼吸平穩。模型組小鼠安靜少動、精神萎靡、毛發粗糙無光澤，其余組與對照組比較，未見明顯變化。

2.2 體重變化 每天觀察小鼠的生長情況并每隔一周稱量小鼠體重。由生長曲線可見，NS組小鼠體重增長最快而模型組小鼠增長最慢，其余各組增長幅度相似。見圖1。

圖1 小鼠生長曲線；NS-正常對照組；BLM-模型組；PFD-吡非尼酮組；Gen50-滇龍膽草低劑量組；Gen100-滇龍膽草中劑量組；Gen200-滇龍膽草高劑量

2.3 肺系數 肺系數是表征肺組織水腫程度的重要指標，模型組小鼠肺系數均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，與模型組比較，吡非尼酮組和滇龍膽草各劑量組小鼠肺系數均有所降低，14 d的吡非尼酮組和滇龍膽草中劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，其余差異無統計學意義(P>0.05)。各組內14 d與28 d比較，14 d各組小鼠肺系數均高于28 d。見表1。

2.4 肺組織Hyp含量 在14 d時，與正常對照組比較，模型組小鼠肺組織Hyp含量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.001)；與模型組比較，滇龍膽草高劑量組小鼠肺組織Hyp含量明顯降低，差異有統計意義(P<0.01)；隨著時間增加，在28 d時，模型組Hyp含量達到峰值，與正常對照組比較，模型組小鼠肺組織Hyp含量明顯升高，差異有統計意義(P<0.01)，各藥物組與模型組比較，Hyp含量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)。結果表明，滇龍膽草可顯著降低肺纖維化小鼠肺組織中Hyp含量。見表1。

表1 肺系數和肺組織Hyp含量統計表

2.5 Western blot檢測肺組織α-SMA蛋白含量 與正常對照組比較，模型組α-SMA蛋白的表達明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，滇龍膽草除28 d低劑量差異無統計學意義(P>0.05)，其余各劑量組均能顯著降低肺組織中α-SMA的相對表達量(P<0.01)，療效與吡非尼酮組相當。見圖2，表2。

圖2 肺組織α-SMA蛋白表達(n=10)

表2 肺組織α-SMA蛋白表達

2.6 肺組織病理學變化 正常對照組小鼠肺組織肺泡結構較完整、清晰，未見肺泡壁增厚肺泡間有少量膠原，無明顯炎性細胞浸潤。模型組小鼠肺組織結構破壞嚴重，部分肺泡塌陷融合，肺泡間隔破壞，肺泡壁明顯增厚，其間可見纖維組織成條索樣、斑片狀分布及炎性細胞浸潤。隨著造模時間延長在肺間質及支氣管周圍可見大量纖維組織增生和膠原沉積。肺泡炎和組織纖維化評分結果顯示，與對照組比較，模型組肺泡炎及間質纖維化評分明顯增加；與模型組比較，滇龍膽草中、高劑量組和吡非尼酮組肺泡炎評分明顯降低，滇龍膽草低、中、高劑量組和吡非尼酮組間質纖維化評分明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、4，表3。

表3 肺組織病理形態學評分 n=10,分,

圖3 病理學形態(HE染色×200)

3 討論

肺纖維化的病理改變以普遍間質性肺炎、廣泛肺內纖維化和瘢痕化、肺內成纖維細胞和肌成纖維細胞異常增殖及大量細胞外基質聚集于肺泡細胞周圍并伴炎癥損傷、組織結構破壞，正常肺泡組織被損壞后異常修復導致肺內疤痕形成[11]。持續的炎性損傷、異常的肺泡上皮修復、成纖維細胞的活化和分化是肺纖維化形成的重要病理過程。

圖4 病理學形態(Masson染色×200)

博萊霉素是一種用于治療腫瘤的抗生素，廣泛用于治療某些類型的惡性腫瘤，包括睪丸癌、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤，肺纖維化是其常見不良反應[12]。氣管內滴注博萊霉素是一種常用的制備肺纖維化動物模型的經典方法。本研究在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型上評價了不同劑量滇龍膽草對肺纖維化形成的干預作用。病理組織學結果發現，滇龍膽草能夠明顯減輕肺纖維化早期肺部炎性反應和后期肺內膠原纖維沉積，能夠干預肺纖維化的形成。

肺系數是表征肺組織水腫程度和炎癥損傷的重要指標。本研究發現，模型組氣管滴注博來霉素14 d肺系數明顯高于28 d，表明肺纖維化早期主要以炎性反應為主，與模型組比較，不同劑量的滇龍膽草能夠降低小鼠肺系數。羥脯氨酸是膠原纖維的重要組成部分，其含量可以反映膠原纖維的含量，常作為纖維化標記物用于表征纖維化組織中膠原蛋白沉積的程度[13]。本研究發現，氣管滴注博萊霉素28 d時模型組小鼠肺組織羥脯氨酸達到峰值，不同劑量的滇龍膽草均能明顯降低肺纖維化小鼠肺組織的羥脯氨酸含量，表明滇龍膽草能夠抑制肺纖維化小鼠肺組織膠原纖維沉積。

活化的肌成纖維細胞是纖維化中最主要的效應細胞，是產生細胞外基質，引起膠原纖維沉積的主要細胞，可特異性表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)。肺纖維化時，肺內肌成纖維細胞主要來源與成纖維細胞的增殖分化、肺上皮細胞間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及循環纖維細胞遷移[14,15]。α-SMA異常高表達是成纖維細胞分化為肌成纖維細胞的標志，也是肌成纖維細胞具有收縮和遷徙能力的結構基礎。本研究發現，模型組在氣管滴注博萊霉素14 d和28 d時，小鼠肺組織α-SMA表達水平均明顯高于正常對照組，表明肺纖維化時肺組織α-SMA表達明顯上調，這與文獻報道[16]一致。不同劑量滇龍膽草和吡非尼酮均可以明顯下調肺纖維化小鼠肺組織α-SMA的表達。結果表明，滇龍膽草可能抑制了肺內成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。

綜上所述，滇龍膽草具有抗肺纖維化作用，能夠抑制肺纖維化形成早期肺部炎癥和后期膠原纖維沉積，其抗肺纖維化作用與下調α-SMA表達，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化有關。本研究可為滇龍膽草防治肺纖維化提供一定的實驗依據，為肺纖維化的治療提供新的治療策略。