circSAMD4A靶向miR-410-3p對缺氧缺糖誘導的神經細胞損傷的影響

劉園園 張培培 陳忠美

缺血性中風發生時，部分腦部供血減少，導致葡萄糖和氧氣供應不足，最終導致腦損傷。重組組織型纖溶酶原激活劑是目前惟一確立的腦卒中治療藥物，但由于時間窗限制具有較大的局限性[1]。腦損傷相關神經功能障礙影響患者的語言、認知和運動功能，嚴重降低患者生活質量。環狀RNA(circRNA)是一類通過特殊的選擇性切割機制產生的非編碼RNA。circRNA可與特定的微小RNA(miRNA)結合，阻止miRNA翻譯，并影響細胞增殖、凋亡、自噬等生物學過程，進而在心血管疾病、神經系統疾病、癌癥的病理過程中發揮作用[2-4]。研究報道急性心肌梗死大鼠心肌組織和缺氧復氧誘導的心肌細胞中circRNA SAMD4A(circSAMD4A)抑制水平上調，circSAMD4A低表達可降低缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡和炎性反應[5]。靶基因數據庫預測到miR-410-3p是circSAMD4A的潛在靶點。研究發現，糖氧剝奪的原發皮層神經元中miR-410-3p水平顯著下調，過表達miR-410-3p可增強神經元存活，抑制神經元凋亡，增加軸突長度，并顯著恢復缺氧缺血性腦損傷大鼠的運動和認知功能[6]。本研究利用PC-12細胞建立體外缺氧缺糖細胞損傷模型模擬缺血性腦損傷過程[7]，研究circSAMD4A靶向miR-410-3p對缺氧缺糖神經細胞凋亡和氧化應激的影響，旨在為缺血性腦損傷治療開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠PC12細胞購自中國典型培養物保藏中心；EBSS無糖培養基、高糖DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；circSAMD4A的小干擾RNA(si-circSAMD4A)、miR-410-3p模擬物(mimics)、miR-410-3p抑制物(anti-miR-410-3p)以及各自陰性對照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC)、熒光素酶報告質粒購自上海生工生物工程公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自北京Takara生物公司；SYBR green master mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自武漢金開瑞生物公司；兔源Cleaved-caspase3抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國CST公司；TRIzol試劑、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒以及丙二醛(MDA)檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液購自北京索萊寶生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于北京全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、模型構建和實驗分組:PC12細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，置于含5%CO2、37℃培養箱中培養，細胞貼壁達到80%時進行傳代培養。將對數期PC12細胞接種到6孔板，每孔2×105個細胞，當細胞貼壁40%時Lipofectamine 2000分別轉染si-NC、si-circSAMD4A、miR-NC、miR-410-3p mimics、si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p至PC12細胞，收集轉染48 h的PC12細胞進行后續實驗。參照文獻[7]方法構建缺氧缺糖模型，即將PC12細胞接種培養板，HANKs液去除懸浮細胞，用EBSS無糖培養基替代DMEM培養基，放入含5% CO2與95% N2的密閉小室中缺糖缺氧損傷4 h，然后取出培養板置于常規培養箱中復氧繼續培養2 h，記為模型(Model)組。用普通高糖DMEM培養基于常規培養箱中培養PC12細胞記為對照(Con)組。轉染si-NC、轉染si-circSAMD4A、轉染miR-NC、轉染miR-410-3p mimics、轉染si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p的PC12細胞進行缺糖缺氧損傷4 h，再復氧繼續培養2 h，分別記為Model+si-NC組、Model+si-circSAMD4A組、Model+miR-NC組、Model+miR-410-3p組、Model+si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p組。

1.2.2 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測circSAMD4A、miR-410-3p表達:用TRIzol試劑從各組PC12細胞中提取總RNA，然后利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成互補DNA。利用SYBR green master mix試劑盒進行RT-qPCR檢測circSAMD4A、miR-410-3p表達水平。實驗所用引物序列(5’-3’)：circSAMD4A上游ACTGGCAGGACAAAAGCATG，下游CAGGATTTTGGGCAGCAGTT；GAPDH上游CAGGAGGCATTGCTGATGAT，下游GAAGGCTGGGGCTCATTT；miR-410-3p上游AAUAUAACACAGAUGG，下游CCTGGCAGTGATGTTGCGGTCTGCCAGGACAGG；U6上游TGGAGCTGCAGAGGATGATT5，下游CAGGGCCTTGAGCACCAGTT。采用2-ΔΔCt法分析circSAMD4A、miR-410-3p的相對水平。circSAMD4A水平檢測以GAPDH為內參，miR-410-3p水平檢測以U6為內參。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力:每組取5×103個PC12細胞接種6孔板，用20 μl的MTT工作液孵育細胞4 h，向各孔內加入二甲基亞砜150 μl。低速搖床震蕩10 min，當藍紫色甲贊結晶溶解后。使用酶標儀檢測各組PC12細胞在490 nm處光密度(OD)值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率:收集各組PC12細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后重懸于1×結合緩沖液中，調整細胞中濃度為1×10個/ml。按照Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測試劑盒說明書，將5 μl的Annexin V-FITC、5 μl的PI依次加到100 μl細胞懸液中，避光孵育20 min。補加400 μl的1×結合緩沖液混勻，流式細胞術檢測各組PC12細胞凋亡率。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達:BCA試劑盒檢測RIPA裂解法提取的各組PC12細胞總蛋白濃度。將適量蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混勻，100℃水浴鍋孵育3～5使蛋白變性。30 μg蛋白樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓100 V，時間90 min)分離，經濕法轉膜儀(20 mA，過夜)轉移蛋白至PVDF膜。膜阻斷后，將膜上的蛋白與1∶1 000的Cleaved-caspase3抗體、GAPDH抗體在4 ℃孵育過夜。第2天與二抗室溫孵育2 h?；瘜W發光試劑盒進行顯色反應，以Image J軟件測得的Cleaved-caspase3和GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白水平。

1.2.6 試劑盒檢測SOD和CAT活性、MDA含量以及LDH釋放量:收集各組PC12細胞，離心后取上清置于新的離心管內，LDH活性檢測試劑盒分析上清中LDH水平以表示LDH釋放量。向細胞沉淀中加入提取液，200 W超聲(超聲3 s，間隔10 s，重復 30 次)于冰上破碎細胞，8 000 g 4℃離心10 min，取上清置于冰上。SOD、CAT活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒分析細胞內SOD和CAT活性以及MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗:根據starbase數據庫預測的circSAMD4A和miR-410-3p的結合位點，將包含miR-410-3p結合位點的circSAMD4A野生(wt)序列以及不含結合位點的circSAMD4A突變(mut)序列分別克隆到pmirGLO基本載體，構建wt-circSAMD4A、mut-circSAMD4A熒光素酶報告質粒。將miR-410-3p mimics、miR-NC分別與wt-circSAMD4A或mut-circSAMD4A共轉染PC12細胞中，收集轉染48 h細胞，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組PC12細胞的相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 干擾circSAMD4A對缺糖缺氧處理的PC12凋亡的影響 與Con組比較，Model組PC12細胞活力、miR-410-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平、circSAMD4A表達水平顯著升高(P<0.05)；與Model組、Model+si-NC組比較，Model+si-circSAMD4A組PC12細胞活力、miR-410-3p表達水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平、circSAMD4A表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達

表1 干擾circSAMD4A抑制缺糖缺氧誘導的PC12凋亡

2.2 干擾circSAMD4A對缺糖缺氧處理的PC12氧化應激的影響 與Con組比較，Model組PC12細胞中SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)，MDA水平、LDH釋放量顯著增加(P<0.05)；與Model組、Model+si-NC組比較，Model+si-circSAMD4A組PC12細胞中SOD和CAT活性顯著升高(P<0.05)，MDA水平、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 干擾circSAMD4A減輕缺糖缺氧誘導的PC12氧化應激

2.3 circSAMD4A靶向miR-410-3p starbase數據庫預測到circSAMD4A序列中含有miR-410-3p的結合位點。同與wt-circSAMD4A共轉染，與轉染miR-NC比較，轉染miR-410-3p mimics后PC12細胞對的相對熒光素活性顯著降低(P<0.05)；同與mut-circSAMD4A共轉染，轉染miR-410-3p mimics后PC12細胞相對熒光素活性與轉染miR-NC比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 circSAMD4A和miR-410-3p互補序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4 抑制miR-410-3p逆轉干擾circSAMD4A對缺糖缺氧處理的PC12凋亡、氧化應激的影響 與Model+si-circSAMD4A組比較，Model+si-circSAMD4A+anti-miR-410-3p組PC12細胞活力、miR-410-3p表達水平以及SOD、CAT活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平、MDA水平、LDH釋放量顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 抑制miR-410-3p可逆轉干擾circSAMD4A對缺糖缺氧誘導的PC12凋亡和氧化應激的抑制作用

流式細胞術檢測細胞凋亡 蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達

2.5 miR-410-3p對缺糖缺氧處理的PC12凋亡氧化應激的影響 與Model組、Model+miR-NC組比較，Model+miR-410-3p組PC12細胞活力、miR-410-3p表達水平以及SOD、CAT活性顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達水平、MDA水平、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表5。

表5 miR-410-3p抑制缺糖缺氧誘導的PC12凋亡和氧化應激

流式細胞術檢測細胞凋亡 蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達

3 討論

腦組織circRNA含量豐富，這些circRNA不僅與神經系統發育、分化和生物學功能有關，在腦損傷后神經系統功能障礙和病理中發揮重要作用[8]。研究發現circRNA 絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1(circTLK1)在缺血性腦卒中動物模型和患者的腦組織和血漿中水平升高，敲減circTLK1可顯著減少梗死體積，減輕神經元損傷，改善隨后的長期神經功能缺損[9]。circRNA HECTD1(circHECTD1)通過調節星形膠質細胞激活加重缺血損傷[10]。此外，circRNA DLGAP4(circDLGAP4)通過靶向miR-143調節與血腦屏障完整性相關的內皮-間充質轉化，改善缺血性卒中預后[3]。本研究發現缺氧缺糖誘導的PC12細胞中circSAMD4A水平增加，提示circSAMD4A表達改變可能與缺血性腦損傷相關。功能喪失實驗顯示，轉染si-circSAMD4A干擾circSAMD4A表達顯著減輕缺氧缺糖誘導的細胞凋亡，增加細胞活力。干擾circSAMD4A表達后Cleaved-caspase3表達下調，證實其可逆轉細胞凋亡。多項研究表明，circSAMD4A在骨肉瘤中參與調節細胞增殖、細胞周期和凋亡[11,12]。氧化應激在缺氧缺糖誘導的細胞凋亡中起著重要作用[13]。本研究顯示，缺氧缺糖誘導細胞損傷標志物LDH釋放，增加脂質過氧化終產物MDA水平，降低抗氧化酶SOD和CAT活性，而干擾circSAMD4A表達顯著逆轉了缺氧缺糖誘導的上述改變。因此，干擾circSAMD4A表達通過抑制氧化應激和凋亡在缺氧缺糖誘導的細胞損傷中發揮神經保護作用。

circRNA可作為miRNA海綿，通過競爭性結合miRNA間接調控miRNA靶基因的表達，參與缺血性腦損傷過程，例如circHECTD1能夠負向調控miR-133b表達加劇大腦中動脈閉塞小鼠模型的腦梗死面積和神經元凋亡[14]。本研究證實miR-410-3p受circSAMD4A調控，是circSAMD4A的直接靶標。據報道，miR-410-3p在七氟醚麻醉誘導的大鼠和細胞中下調，并在七氟醚麻醉誘導的海馬神經元凋亡和炎癥中發揮抑制作用[15]。肝刺激因子通過上調miR-410-3p等幾種miRNA表達，抑制周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)水平，抑制肝細胞凋亡，進而減輕肝臟缺血再灌注損傷[16]。本研究表明，缺氧缺糖誘導的PC12細胞中miR-410-3p水平降低，過表達miR-410-3p可提高SOD和CAT活性，降低MDA水平，抑制LDH釋放，改善缺氧缺糖誘導的凋亡和氧化應激損傷。由于干擾circSAMD4A表達可增加缺氧缺糖PC12細胞中miR-410-3p水平，且過表達miR-410-3p和干擾circSAMD4A的神經保護作用類似，表明可能存在circSAMD4A/miR-410-3p調控途徑。進一步研究發現，抑制miR-410-3p表達可減弱干擾circSAMD4A對缺氧缺糖誘導的PC12細胞損傷的保護作用，這表明circSAMD4A靶向負調控miR-410-3p表達參與調控缺氧缺糖誘導的神經細胞損傷。

綜上所述，本研究首次證實干擾circSAMD4A通過靶向miR-410-3p可減輕缺糖缺氧誘導的神經細胞損傷，具有神經保護作用。靶向抑制circSAMD4A/miR-410-3p途徑可能是預防或治療缺血性腦損傷的有效途徑。