復發性腦膠質瘤組織TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達與細胞增殖侵襲惡性行為的關系及預測預后的效能

胡杜鵑 任娟

腦膠質瘤是臨床常見中樞神經系統惡性腫瘤，發病率達全部顱內腫瘤的50%以上[1]。目前手術聯合放化療是臨床治療腦膠質瘤主要手段，但此疾病惡性程度高，且呈彌漫性浸潤，治療難度大，術后易復發，患者預后差。因此，如何能有效評估患者預后轉歸以積極完善治療方案對確保此類患者預后尤為重要。四跨膜超家族成員1蛋白(TM4SF1)是一種腫瘤相關抗原，最早被發現于人上皮來源的惡性腫瘤內。研究顯示，TM4SF1 mRNA在肝癌、結腸癌等惡性腫瘤組織內高表達，可促進惡性細胞侵襲、遷移[2]。miR-542-3p是miRNA家族成員，岑小寧等[3]指出，其在腸癌細胞內高表達可降低惡性細胞遷移能力，并提出miR-542-3p表達可能與惡性細胞遷移行為有關。鋅是細胞生長、分化、發育所必需的微量元素。有研究表明，腫瘤內常出現鋅離子水平異常情況，且此特征與鋅轉運體1(ZnT1)活性關系密切[4]。本研究探討復發性腦膠質瘤組織TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達與細胞增殖侵襲惡性行為的關系及預測治療反應性的效能，為臨床完善相關診療機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月至2020年3月我院收治的169例復發性腦膠質瘤患者，根據6個月預后情況分為死亡組、生存組。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①初診經病理診斷確診腦膠質瘤[5]，術后治療首次復發；②滿足二次手術指征；③卡氏(KPS)功能狀態評分≥60分；④患者、家屬知情理解簽署同意書。

1.2.2 排除標準：①伴肝腎心等主要臟器嚴重疾病者；②有腦梗死、腦膜炎等其他腦部疾病者；③有精神疾病及認知障礙者；④伴其他惡性腫瘤疾病者。

1.3 方法 術中留取腦膠質瘤組織標本，取50 g標本加入自動勻漿器勻漿，孵育5 min(15～30℃)，待完全裂解，離心(10 min，轉速12 000 r/min，半徑10 cm)提取RNA，純化，反轉錄，孵育(37℃)50 min，保溫(70℃)10 min，反應結束將cDNA置-20℃保存。采用賽默飛世爾中國熒光定量PCR儀(7500型)測TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p。擴增程序95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，45個循環。TM4SF1引物設計：上游引物5’-TCGGCCAGTGGAACTACACCTTT-3’，下游引物5’-TCCACCAAGAGCCAAGAGGATAGA-3’；ZnT1 引物設計：上游引物5’-TGATGGCTATTATGGACGAG-3’，下游引物5’-GGAGCGTTTCCCAAGC-3’；miR-542-3p引物設計：上游引物5’-GGCGGTGTGACAGATTGATAA-3’，下游引物5’-TCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTCAG A-3’。

1.4 觀察指標 (1)比較2組基線資料、組織各指標。(2)比較組織各指標不同表達水平對細胞增殖侵襲惡性行為的影響。細胞增殖侵襲惡性行為采用2016年世界衛生組織(WHO)中樞神經系統腫瘤分類標準[6]進行評價。(3)分析預后影響因素及組織各指標預測預后的效能。(4)對比各指標不同表達水平患者生存率。

2 結果

2.1 2組基線資料、組織各指標比較 169例復發性腦膠質瘤患者，隨訪6個月，失訪2例，167例獲訪患者中，死亡25例，生存142例。2組年齡、性別、體質量指數、KPS評分、合并疾病、腫瘤位置、術后輔助治療比較，差異無統計學意義(P>0.05)；死亡組距離首次手術時間、腦膠質瘤WHO分級、腫瘤切除程度、TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達與生存組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組基線資料、組織各指標比較

2.2 各指標不同表達水平對細胞增殖侵襲惡性行為影響 以2組TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達均值為分界進行分層，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p高表達與低表達患者WHO分級比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 預后影響因素的Cox比例風險回歸模型分析 以預后情況作為因變量(0=生存，1=死亡)，以2組比較篩查出的有統計學意義的指標：TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p作為自變量(低表達賦值1，高表達賦值為2)，建立Cox比例風險回歸模型，結果顯示，將距離首次手術時間、腦膠質瘤WHO分級、腫瘤切除程度控制后，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p仍與患者預后相關，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 預后影響因素的Cox比例風險回歸模型分析

2.4 各指標預測預后的效能 以死亡組為陽性樣本，以存活組為陰性樣本，繪制各指標預測預后的ROC曲線，結果顯示，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p預測預后的AUC分別為0.829、0.798、0.759(P<0.05)；采用聯合應用ROC理論模式，對各單獨應用指標進行綜合回歸，建立Logistic預測評估模型，結果顯示，TM4SF1 mRNA+ZnT1 mRNA+miR-542-3p預測預后的AUC為0.938(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 ROC分析結果

圖1 組織各指標預測預后的效能

2.5 各指標不同表達水平患者生存率比較 根據ROC分析cut-off值，將患者分為TM4SF1 mRNA高危(>2.07)與低危(≤2.07)、ZnT1 mRNA高危(>0.76)與低危(≤0.76)、miR-542-3p高危(≤0.74)與低危(>0.74)患者生存率，應用K-M生存曲線分析，結果顯示，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p高危患者生存率與低危患者比較，差異有統計學意義(χ2=9.377、6.789、14.869，P=0.002、0.009、<0.001)。見圖2～4。

圖2 不同TM4SF1 mRNA表達者生存率比較 圖3 不同ZnT1 mRNA表達者生存率比較 圖4 不同miR-542-3p表達者生存率比較

3 討論

腦膠質瘤常呈浸潤性生長，無顯著界限，具高復發率、病死率，低治愈率等特征[7]。有研究顯示，腦膠質瘤3年生存率不足9%[8]。本研究對復發性腦膠質瘤患者再手術后隨訪發現，6個月病死率即達14.97%。上述研究均提示臨床急需加強對腦膠質瘤惡性行為相關研究并有效指導臨床完善此疾病診療機制，以提升患者生存率。

TM4SF1 mRNA定位在人3號染色體上，可編碼TM4SF1低分子糖蛋白。近年研究發現，TM4SF1在多種惡性腫瘤發生發展過程中具有重要作用，如：TM4SF1被募集到TERM區及相關泛素化修飾后可刺激惡性細胞發生遷移，但其與復發性腦膠質瘤惡性行為間關系如何，尚無定論[9]。本研究發現，隨TM4SF1 mRNA表達升高，腦膠質瘤WHO分級呈升高趨勢，且生存與死亡患者間復發性腦膠質瘤組織內TM4SF1 mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)，提示TM4SF1 mRNA過表達可能與腦膠質瘤惡性行為有關。分析主要是因TM4SF1 mRNA高表達可顯著增強腦膠質瘤細胞侵襲，同時其在腫瘤血管內皮細胞中亦呈高表達狀態可促進血管新生，而腦膠質瘤發生發展過程中，病理性血管新生及惡性細胞侵襲性均起到關鍵性作用[10]。因此，腦膠質瘤組織TM4SF1 mRNA高表達時可能通過促進惡性細胞侵襲及病理性血管生成兩個層面而增加復發風險，或可為臨床完善此疾病診療機制提供參考。

ZnT1與腦中鋅離子代謝關系密切，是鋅轉運體家族主要成員。目前ZnT1已得到廣泛證實，可通過調節CDK2活性而影響G1/S期轉化，同時能通過影響基質金屬蛋白酶活性而調節細胞侵襲能力[11,12]。本研究對不同預后的腦膠質瘤患者進行研究發現，死亡組ZnT1 mRNA表達高于生存組(P<0.05)，初見此結果與鋅元素有助于維持細胞正常生理功能的特性相悖，但結合現有研究[13,14]不難分析，腦膠質瘤細胞在快速增殖及發生侵襲行為的同時，機體通過一系列生理功能對抗腦膠質瘤細胞增殖，故腦膠質瘤惡性程度越高，ZnT1 mRNA表達隨之越高，但此疾病發生發展是多因素、多過程作用的結果，單純ZnT1 mRNA高表達難以阻止其惡性行為。

此外，miR-542-3p是一種新發現微小mRNA，通過研究其生物學特性發現，miR-542-3p可與凋亡抑制基因Survivin所編碼mRNA 3’端非編碼區選擇性結合，繼而抑制Survivin蛋白生成。有研究顯示，腦膠質瘤組織內miR-542-3p表達顯著降低，miR-542-3p表達降低程度與預后不良有關[15]。本研究亦發現miR-542-3p低表達時腦膠質瘤WHO分級偏高，說明miR-542-3p可能具有抑癌基因作用，其表達降低時可致機體抗腦膠質瘤發生發展能力減弱，此結論同樣可部分解釋ZnT1 mRNA高表達時，腦膠質瘤細胞惡性行為活躍的原因。結合以上TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達在復發性腦膠質瘤組織中的生物學特征，或可應用于預后評估。但還有研究顯示，腫瘤切除程度、腦膠質瘤WHO分級等均與復發性腦膠質瘤患者預后有關，腫瘤切除程度越高越利于控制病情[16]。Cox比例風險回歸模型校正距離首次手術時間、腦膠質瘤WHO分級、腫瘤切除程度后，TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p仍與患者預后相關，且聯合預測預后的AUC為0.938，大于單一指標預測(P<0.05)，提示TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p與預后有關，聯合檢測可為臨床評估預后提供客觀依據，因此，針對TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA升高，miR-542-3p降低的高危患者，需積極完善治療方案以確保患者能獲益最大化。

綜上可知，腦膠質瘤組織TM4SF1 mRNA、ZnT1 mRNA、miR-542-3p表達與細胞增殖侵襲惡性行為關系密切，是預后的主要影響因素，三者聯合可為臨床預測預后提供參考依據。