HMGA2基因缺失對PM2.5暴露致大鼠肺損傷和心功能不全的影響

張鈺凡 余宏鑫 唐宋 梁建軍

大氣細顆粒物2.5(particulate matter 2.5，PM2.5)污染已成為威脅中國和其他發展中國家公眾健康的重大問題[1]。流行病學研究表明，長期暴露于空氣中的高濃度PM2.5環境中會增加呼吸道和心血管疾病的風險，如哮喘、支氣管炎、慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、冠狀動脈疾病和心力衰竭[2]。毒理學研究也證實，PM2.5暴露對健康的不良影響與炎癥和氧化應激的增強有關，從而可能導致肺損傷和心功能不全[3]。考慮到環境PM2.5多年來一直處于高水平，空氣質量短期內無法改善，尋找有效的治療方法減少PM2.5相關疾病迫在眉睫。然而，PM2.5導致肺損傷和心功能不全的機制尚不清楚。高遷移率族蛋白 A2(high mobility group protein A2，HMGA2)是HMGA家族(HMGA1a，HMGA1b，HMGA1c和HMGA2)的重要成員，對于細胞的生長和分化非常重要，還參與了上皮-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transformation，EMT)[4]。另有研究表明，HMGA1在核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的作用下，激活炎癥和增殖相關基因[5]。同時，NF-κB活化與血漿和組織中促炎細胞因子水平的升高密切相關，可作為感染性疾病治療的生物標志物和靶點[6]。然而，HMGA2基因缺失對PM2.5暴露致大鼠肺損傷和心功能不全的的作用研究還很少。因此，本研究將PM2.5暴露誘發野生型(Wild type，WT)和HMGA2基因敲除(HMGA2-/-)大鼠炎性反應和氧化應激，并對肺功能和心功能進行檢測，以確定通過HMGA2途徑保護PM2.5誘導的大鼠肺損傷和心功能不全。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級WT大鼠(10只)和HMGA2-/-大鼠(10只)，體質量(200±20)g，購自卡文斯實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK(蘇)2020-0010，在溫度(23±2)℃、相對濕度為45%～55%的環境中適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器 白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、3-硝基酪氨酸(3-Nitrotyrosine，3-NT)和4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal，4-HNE)酶聯免疫吸附(Enzyme-linked immunoadsorption，ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解緩沖液(上海生工生物工程有限公司，批號：175056)；HMGA2、NF-κB、過氧化物還原酶5(Peroxiredoxin，PRDX5)、GADPH和HRP標記山羊抗鼠二抗(美國Santa Cruz公司)；ECL化學發光液(美國GE公司)；TH-150D型智能中流量空氣總懸浮顆粒物采樣器(武漢市天虹儀表有限責任公司)；AniRes2005動物肺功能分析系統和RES3020動物呼吸機(北京貝蘭博科技有限公司)；VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；Sunrise型全自動酶標儀(瑞士Tecan公司)；BD垂直電泳儀(美國BD公司)；2500凝膠成像和分析系統(上海天能科技有限公司)。

1.3 PM2.5混懸液的制備 用TH-150D型智能中流量空氣總懸浮顆粒物采樣器連續24 h進行PM2.5采集，用液氮冷凍干燥成粉，4℃保存。用10 mg PM2.5粉末溶于4.8 ml 0.9%氯化鈉溶液中等到PM2.5混懸液(現用現配)。

1.4 分組及造模 將WT大鼠按體重用隨機數字表法分為對照組和PM2.5組，每組5只；將HMGA2-/-大鼠按體重用隨機數字表法分為HMGA2-/-組和HMGA2-/-+PM2.5組，每組5只。對照組和HMGA2-/-組大鼠每天氣管滴注0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液，PM2.5組和HMGA2-/-+PM2.5組每天氣管滴注0.3 ml PM2.5混懸液，連續4周后進行相關檢測[7]。

1.5 心功能檢測 末次干預1 h后，對大鼠進行麻醉，將探頭置于胸骨左緣，采用VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀分別測量左心室射血分數(LVEF)和左心室縮短分數(LVFS)。

1.6 大鼠肺功能檢測 做完心功能檢測，將大鼠置于體描箱中，行氣管插管，鏈接RES3020動物呼吸機，待數據曲線穩定后用AniRes2005動物肺功能分析系統采集力肺活量(FVC)和最大通氣量(MVV)。

1.7 血清中IL-6、TNF-α、3-NT和4-HNE水平的檢測 對大鼠進行心臟取血處死大鼠，分離肺和心臟，進行凍存；離心分離血清，根據試劑盒說明書，用MSunrise型全自動酶標儀測定血清中IL-6、TNF-α、3-NT和4-HNE水平。

1.8 組織中HMGA2、NF-κB和PRDX5水平檢測 每只大鼠分別取100 mg心臟和肺組織，制成勻漿，加入1 ml RIPA裂解緩沖液，裂解2 h后離心取上清，加入1/5體積的5×Buffer，在沸水中變性，進行電泳(20 μg/孔)、切膠、轉膜，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜(1 h)，將膜與HMGA2(1∶400)、NF-κB(1∶400)和PRDX5(1∶300)進行孵育(4℃過夜)，將膜與HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)在室溫下孵育(30 min)，用ECL化學發光液進行顯色，采集圖像進行分析(以GADPH作為內對照)。

2 結果

2.1 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠肺功能和心功能的影響 與對照組比較，HMGA2-/-組各指標差異無統計學意義(P>0.05)，PM2.5組和HMGA2-/-+PM2.5組大鼠FVC、MVV、LVEF和LVFS降低(P<0.05)；與PM2.5組比較，HMGA2-/-+PM2.5組大鼠FVC、MVV、LVEF和LVFS降低(P<0.05)。見表1。

表1 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠肺功能和心功能的影響

2.2 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠血清中IL-6、TNF-α、3-NT和4-HNE水平的影響 與對照組比較，HMGA2-/-組各指標差異均無統計學意義(P>0.05)，PM2.5組和HMGA2-/-+PM2.5組大鼠血清中IL-6、TNF-α、3-NT和4-HNE增加(P<0.05)；與PM2.5組比較，HMGA2-/-+PM2.5組大鼠血清中IL-6、TNF-α、3-NT和4-HNE增加(P<0.05)。見表2。

表2 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠血清IL-6、TNF-α、3-NT和4-HNE水平影響

2.3 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠肺組織中HMGA2、NF-κB和PRDX5水平的影響 HMGA2-/-組和HMGA2-/-+PM2.5組大鼠肺組織中HMGA2無表達；與對照組比較，PM2.5組肺組織中HMGA2降低(P<0.05)；與對照組比較，HMGA2-/-組各指標差異無統計學意義(P>0.05)，PM2.5組和HMGA2-/-+PM2.5組大鼠肺組織中NF-κB增加、PRDX5降低(P<0.05)；與PM2.5組比較，HMGA2-/-+PM2.5組大鼠肺組織中NF-κB增加、PRDX5降低(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠肺組織中HMGA2、NF-κB和PRDX5水平的影響

圖1 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠肺組織中HMGA2、NF-κB和PRDX5水平的影響；A 對照組；B HMGA2-/-組；C PM2.5組；D HMGA2-/-+PM2.5組

2.4 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠心臟組織中HMGA2、NF-κB和PRDX5水平的影響 HMGA2-/-組和HMGA2-/-+PM2.5組大鼠心臟組織中HMGA2無表達；與對照組比較，PM2.5組心臟組織中HMGA2降低(P<0.05)；與對照組比較，HMGA2-/-組各指標差異無統計學意義(P>0.05)，PM2.5組和HMGA2-/-+PM2.5組大鼠心臟組織中NF-κB和PRDX5降低(P<0.05)；與PM2.5組比較，HMGA2-/-+PM2.5組大鼠心臟組織中NF-κB和PRDX5降低(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠心臟組織中HMGA2、NF-κB和PRDX5水平的影響

圖2 HMGA2基因缺失對PM2.5暴露大鼠心臟組織中HMGA2、NF-κB和PRDX5水平的影響；A 對照組；B HMGA2-/-組；C PM2.5組；D HMGA2-/-+PM2.5組

3 討論

隨著PM2.5濃度的增加，患肺部和心臟疾病的風險增加[8]。由于PM2.5易被吸入氣道并沉積在肺泡中，大鼠急性暴露于高濃度PM2.5可引起肺病理損傷，包括肺泡壁增厚、肺泡間隙減少、線粒體結構異常改變等[9]。心臟是PM2.5的另一個主要靶器官，PM2.5對心肌的直接影響包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成、自發性心律失常及心肌血流改變等[10]。本研究結果顯示，PM2.5暴露可以導致大鼠肺功能和心功能損傷。此外，HMGA2基因敲除加劇了PM2.5暴露大鼠肺功能和心功能損傷。研究證明，HMGA2活性受損可在應激條件下誘發呼吸系統和心血管系統代謝紊亂[11]。同時，本研究結果顯示，PM2.5暴露會導致大鼠肺組織和心臟組織中HMGA2降低。

研究表明，激活HMGA2可減輕炎癥，而抑制HMGA2可加重由不同傷害性刺激引起的炎癥[12]。HMGA2激活可以通過磷酸化轉錄共激活因子p300來抑制NF-κB活性，或通過調節沉默信息調節因子-1(silent information regulator-1，SIRT1)、p53和叉頭狀轉錄因子O(Forkhead box O，FoxO)間接調節NF-κB活性[13]。本研究結果顯示，HMGA2敲除會加劇PM2.5暴露大鼠肺組織和心臟組織中NF-κB的激活。

PM2.5具有誘導高水平ROS的能力，細胞內ROS的過量產生導致炎性細胞因子釋放和DNA損傷，從而導致肺損傷。同時，PM2.5暴露也可能通過降低抗氧化酶的表達促進氧化應激[14]。雖然HMGA2長期以來被認為是代謝調節因子，但在某些條件下，HMGA2可調節ROS的產生和氧化應激[15]。例如，HMGA2激活誘導成纖維細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α)依賴的抗氧化反應[16]。PGC-1α是響應氧化應激的線粒體抗氧化基因表達的重要調控因子，在壓力超載的PGC-1α-/-小鼠中，心肌PRDX5表達降低。PGC-1α缺乏也降低了出生后心臟生長過程中PRDX5的表達[17]。本研究推測，HMGA2可能通過PGC-1α依賴通路調控PRDX5的表達。最近研究也證實，在小管上皮細胞中，活化HMGA2可增加PRDX5的表達，而抑制HMGA2可降低PRDX5的表達[18]。本研究結果顯示，PM2.5暴露顯著增加了血清中3-NT和4-HNE水平，這與線粒體抗氧化酶(PRDX5)的降低有關，而HMGA2缺失特異性降低了PM2.5暴露大鼠肺和心臟中PRDX5的表達，增加了氧化應激。由于PRDX5是一種抗氧化酶，可降低H2O2、烷基氫過氧化物和過氧亞硝酸鹽的含量[19]。因此，PRDX5的降低可能是PM2.5暴露后HMGA2-/-大鼠肺和心臟氧化應激增強的原因之一。

綜上所述，HMGA2基因敲除能提高NF-κB水平和抑制PRDX5水平，使PM2.5暴露大鼠血清中炎性反應(IL-6和TNF-α)和氧化應激(3-NT和4-HNE)水平增加，顯著加重了PM2.5暴露大鼠肺損傷和心功能不全。本研究結果表明，增加HMGA2活性可能是治療空氣污染相關疾病的一種潛在策略。