不同生長(zhǎng)期黃芩莖葉中野黃芩苷的含量變化＃*

王圣常 田素青 候愛霞 靳維榮

1.梁山縣中醫(yī)醫(yī)院中藥房,山東 濟(jì)寧 272600;2.濟(jì)寧市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,山東 濟(jì)寧 272000;3.泰安中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,山東 泰安 270000;4.山東省聊城市人民醫(yī)院中藥研究室,山東 濟(jì)寧 252004

有關(guān)黃芩的記載,最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中可以看到,黃芩屬于唇形科多年的草本植物,黃芩主要分布于我國(guó)的華北、東北和西南等地區(qū)。黃芩作為一種中藥材,中醫(yī)上在進(jìn)行用藥時(shí),主要使用的時(shí)黃芩根,暴露在地上的黃芩莖和黃芩葉通常不作為中醫(yī)用藥的材料。但是,在進(jìn)行實(shí)際采摘的過程中,很多非傳統(tǒng)黃芩用藥的部分,比如黃芩的葉、莖部與花朵等也和黃芩根一起采收了。且這部分中藥材的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于黃芩根的產(chǎn)量。但黃芩根之上的莖、葉與花都未得到充分利用,不僅造成了環(huán)境污染,還浪費(fèi)了大量資源[1]。黃芩地上部分莖葉所含黃芩苷含量遠(yuǎn)低于根部,但野黃芩苷含量高達(dá)黃芩苷的10倍,幾乎與根部持平[2]。

在中醫(yī)范疇內(nèi),黃芩性寒,有苦味,有清熱解毒、下火燥濕、止血安胎的功效。而且,現(xiàn)代研究表明,黃芩莖葉具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降壓、降血脂、解熱、鎮(zhèn)痛、提高機(jī)體免疫力等藥理學(xué)活性和高效低毒的特點(diǎn),主要化學(xué)成分包括黃芩苷、野黃芩苷等黃酮類化合物[3]。過氧化物酶(POD)在植物體內(nèi)比較常見,是一種活性比較高的酶。而且,在不同物種的不同生長(zhǎng)時(shí)期,或是同一物種的同一時(shí)期的不同器官,以及同一器官不同組織內(nèi),都存在特異性。近幾年,黃芩莖葉的研究已成為熱點(diǎn),通過我們前期對(duì)不同時(shí)期黃芩成分的研究,以及黃芩不同器官在不同采收期的過氧化物同工酶研究中發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)期的黃芩POD同工酶種類發(fā)生變化。植物體內(nèi)各種酶類變化會(huì)引起相應(yīng)控制的化學(xué)成分變化,黃芩莖葉中以野黃芩苷為代表的黃酮類是否也發(fā)生相應(yīng)的變化,目前還沒有研究。本文采用反相高效液相色譜梯度洗脫法對(duì)不同生長(zhǎng)期黃芩莖葉中野黃苷含量進(jìn)行檢測(cè),以期為黃芩莖葉最佳采收期提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究材料

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100,美國(guó)安捷倫科技公司)；色譜純:甲酸、甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心),其余試劑為分析純；野黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)27740ˉ01ˉ8)。

1.2 試驗(yàn)藥材 黃芩莖葉:此次試驗(yàn)使用的樣品已經(jīng)由山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定,鑒定結(jié)果為本研究中黃芩莖葉均為干燥的黃芩莖葉。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察本次研究中黃芩苷、野黃芩苷線性范圍及一年中不同采收期黃芩莖葉中野黃芩苷的含量。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 選用比較常用的C18高效液相色譜儀,色譜柱:Phenomenex Prodigy ODS3一C18(4.60 mm x 250 mm,5μm),流動(dòng)相:甲醇ˉ0.02%(28:72)甲酸,流速為1.0ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣體積為5μL。將流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間程序進(jìn)行調(diào)整,見表1。

表1 梯度洗脫時(shí)間表

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取適量野黃芩苷對(duì)照品,用甲醇配制成濃度分別為0.096mg·mlˉ1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取黃芩莖葉各0.3g,精密稱取后,加入濃度70%的40ml乙醇,加熱回流3.0 h,放冷,濾過,濾液置100ml容量瓶中,取少量的70%乙醇對(duì)容器和殘?jiān)M(jìn)行分次洗滌,洗液濾入同一量瓶中,加70%乙醇至刻度,搖勻,即得。

2.4 線性范圍的考察 精密量取上述野黃芩苷對(duì)照品溶液,照品溶液,分別進(jìn)樣5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,20.0μl,按上述色譜條件測(cè)定峰面積值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積值為縱坐標(biāo)(Y),得回歸方程:Y＝196.4X＋216.55,r＝0.9994,結(jié)果表明野黃芩苷進(jìn)樣量在0.470 0～1.8800μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果圖2和表2。

表2 野黃芩苷、黃芩苷線性范圍Table 4-8 Linear ranges of scutellarin and baicalin

圖2 野黃芩苷、黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Linear ranges of scutellarin and baicalin

2.5 精密度考察 精密吸取對(duì)照品15μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定野黃芩苷峰面積,其RSD為0.3%,說明儀器精密度和方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液5μl,分別測(cè)定0,1,2,3,5,9,12,24,48,72 h野黃芩苷在72h內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.86%,說明樣品在72 h內(nèi)穩(wěn)定,表明樣品溶液在72 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

3 樣品重復(fù)性良好。

3.1 樣品含量測(cè)定取黃答莖葉各0.3g,精密稱定,按“2.1”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)黃答莖和葉進(jìn)行含量測(cè)定,每批平行測(cè)定3份,計(jì)算其含量,樣品圖譜見圖5～7。結(jié)果見表5～7。

圖5 .混合對(duì)照品HPLC圖

Fig.5 HPLC of reference substance

圖6 .黃芩莖葉HPLC圖譜

Fig.6 HPLC of Radix Scutellaria

表3 黃芩莖葉中黃酮類成分的含量(n＝3)

圖4 11黃芩莖葉中黃酮類成分的含量

2.6 不同生長(zhǎng)期黃芩莖葉中野黃芩苷含量變化 采收1年中不同生長(zhǎng)期的黃芩莖葉約1g,精密稱定后,按“2.1”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)野黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定總黃酮中的野黃芩苷含量,見表4。

表4 年中不同生長(zhǎng)期黃芩莖葉中野黃芩苷含量(n＝3)

4 討 論

黃芩在中藥材中屬于大宗藥材,而我國(guó)每年都會(huì)生產(chǎn)大量的黃芩莖葉,但對(duì)于黃芩藥材的管控并無嚴(yán)格規(guī)定。近幾年來,隨著有關(guān)黃芩莖葉的研究不斷深入,如何充分利用黃芩莖葉資源也成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。由于目前國(guó)家和地方尚無明確的黃芩莖葉藥材使用標(biāo)準(zhǔn),也無有關(guān)黃芩莖葉研制、生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)等方面的明確規(guī)定,導(dǎo)致黃芩莖葉藥材的管理也受到了限制。因此,加強(qiáng)對(duì)黃芩莖、葉等不同部位的野黃芩苷含量進(jìn)行測(cè)定,既有助于明確黃芩莖葉的化學(xué)成分生物合成機(jī)理,也有利于確定黃芩莖葉藥材最佳的采收期。同時(shí),還能夠?yàn)辄S芩莖葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

在前期的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),使用高效液相色譜法對(duì)黃芩莖、葉和花進(jìn)行檢測(cè)是,黃芩莖、黃芩葉和黃芩花中的野黃芩苷色譜峰信號(hào)比較強(qiáng),因此,試驗(yàn)可以選擇野黃芩苷作為檢測(cè)的指標(biāo)。并對(duì)采用不同提取方法對(duì)野黃芩含量檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行分析,結(jié)果顯示采用70%乙醇作為提取溶劑的時(shí)候,先將其靜置半小時(shí),再使用超聲進(jìn)行處理半小時(shí),最后測(cè)定的黃芩莖、葉和花中野黃芩苷含量最多。因?yàn)榭紤]到超聲提取的測(cè)定方法比較簡(jiǎn)單易操作,因此,在進(jìn)行研究時(shí),可以選擇70%乙醇超聲檢測(cè)的方式進(jìn)行提取。通過掃描紫外光譜的結(jié)果顯示,335nm波長(zhǎng)下吸收最大,因此在試驗(yàn)時(shí)可以選擇335nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)的波長(zhǎng)。

在本次研究中,采用HPLC法來測(cè)定黃芩莖葉中野黃芩苷的含量,并分別對(duì)一年中不同生長(zhǎng)期內(nèi)黃芩莖葉中的野黃芩苷進(jìn)行測(cè)定,研究結(jié)果顯示不同生長(zhǎng)時(shí)期黃芩莖、葉中的野黃芩苷含量也存在變化,而7、8月份黃芩莖葉中的野黃芩苷含量比其他月份的野黃芩苷含量更高。研究結(jié)果說明,黃芩莖葉最佳的采收期是秋季7、8月份的時(shí)候。從化學(xué)成分上看,野黃芩苷是黃酮類化合物,通常存在于糖結(jié)合或是游離狀態(tài)的中藥材中。在植物的葉子、花朵與果實(shí)等組織中,野黃芩苷主要以苷的形式存在,在植物莖部則以游離苷元的狀態(tài)存在[5]。在植物體內(nèi)的生物合成途徑中,黃酮類化合物多為復(fù)合型,是乙酸ˉ丙二酸和莽草酸途徑生物合成的產(chǎn)物。而查爾酮異構(gòu)酶和查爾酮合成酶經(jīng)形成二氫黃酮,再由植物體內(nèi)其他酶作用后,形成野黃芩苷。由于上述兩種原因,黃芩葉中野黃芩苷的含量比黃芩莖中的含量高。

黃芩作為多年草本植物,黃芩莖葉最佳的開花期是7ˉ8月份的時(shí)候,8ˉ9月份是果實(shí)成熟期。這個(gè)時(shí)間在北方正值夏秋交替之際,夏天植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)為生殖生長(zhǎng)期,受到氣候的影響,黃芩莖葉也逐漸開始枯萎、凋落。除此之外,黃芩葉比較脆,采收、晾曬和運(yùn)輸期間容易出現(xiàn)脫落的情況,郭梅[6]等人的研究結(jié)果顯示,同一生長(zhǎng)期內(nèi)黃芩莖、葉中的野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩苷和木犀草素等黃酮類化合物含量差異較大。其中,黃芩莖、葉中的野黃芩苷含量高于其他3種黃酮類化合物含量,該研究結(jié)果與本次研究的結(jié)果有相符之處。另外,郭梅等人的研究結(jié)果顯示黃芩葉中野黃芩苷的含量在5月最高,主要原因在于5ˉ6月份是黃芩莖葉生長(zhǎng)期,處于地上部分的黃芩葉生長(zhǎng)旺盛,黃芩根部合成的黃酮類化合物轉(zhuǎn)移至地上部分,因而使得黃芩葉中的野黃芩含量增加。另外,從本次研究測(cè)定的結(jié)果看,黃芩葉中的黃芩苷含量明顯比黃芩莖中的黃芩苷含量高,因此,在黃芩莖葉的藥材質(zhì)量檢測(cè)中還需要添加有關(guān)黃芩莖葉的檢查項(xiàng)目,并對(duì)稱取的重量設(shè)定標(biāo)準(zhǔn),以便為黃芩莖葉藥材的質(zhì)量判斷,提供相應(yīng)的參考依據(jù)。

綜上所述,高效液相色譜法可以測(cè)定不同生長(zhǎng)期黃芩莖葉中也黃芩苷的含量水平,確定黃芩莖葉最佳采收期,能夠?yàn)辄S芩莖葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。