中國對蝦Gs基因克隆及其在急性低鹽脅迫下功能分析

周雨欣 何玉英, 李 健, 魏 威, 王 瓊, 謝擁軍

(1. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306; 2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所, 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 青島 266235; 4. 青島農業大學海洋科學與工程學院, 青島 266237;5. 河北省水產良種與漁業環境監測保護總站, 石家莊 050000)

鹽度的變化能影響生物體的正常活動, 是能影響水生甲殼動物正常發育的一種非常重要的生態因子[1—3]。大量降水導致池塘水鹽度改變造成水生甲殼動物體內滲透壓失衡, 引起一系列生理適應性反應[4,5]。暴雨造成的池塘鹽度急劇變化往往會導致中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)機體免疫力下降[6]。Spanings-Pierrot等[7]研究發現多巴胺在維持滲透壓平衡中發揮一定作用; 潘魯青等[8]發現低鹽對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)鰓絲Na+-K+-ATPase活力有一定影響, 鹽度越低酶活力越大;高鹽脅迫對中國對蝦的生長存活無顯著影響[9—11];馬金武等[12]發現三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)在急性鹽度脅迫下具有較強的滲透調節能力,但未見有關中國對蝦在急性低鹽脅迫下滲透調節變化的研究。

鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(Guanine nucleotide binding protein, Gs)是一種重要的信號傳導分子, 可通過直接調節離子通道、激活第二信使等方式參與細胞信號傳導。多巴胺(DA)屬于生物胺的一種,是一種信號分子, 能夠參與甲殼動物體內的離子轉運過程[7]。Na+-K+-ATPase是一種調節滲透壓的非常重要的酶[13,14]。當水生甲殼動物受到急性低鹽脅迫時, Na+-K+-ATPase能通過調節離子轉運對滲透壓調節過程發揮重要作用[15—18]。Neufeld等[19]和Savage等[20]認為生物胺能夠短期調節Na+-K+-ATPase活力。環境鹽度急劇變化時, 生物胺合成酶產生DA, 通過Gs傳導信號, 激活AC將ATP轉化成cAMP, cAMP與PKA相耦聯, 通過PKA激活Na+-K+-ATPase, 進行滲透調節[21,22]。Lucu等[23]在對雜色瘦方蟹(Leptograpsus variegatus)的研究中發現將DA或cAMP注射到體內能激活Na+-K+-ATPase。在三疣梭子蟹中研究發現低鹽脅迫下DA與 Na+-K+-ATPase變化趨勢一致[5]。

本文通過探究急性低鹽脅迫下Gs基因在中國對蝦中的表達情況以及cAMP信號通路內多個指標的變化情況, 探討低鹽脅迫下Gs基因參與中國對蝦滲透壓調節機制, 為解析中國對蝦在低鹽脅迫下的環境適應性提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物均取自日照開航水產養殖有限公司,隨機選用平均體長為(11.59±0.96) cm, 平均體重為(21.29±2.47) g的活力好且規格整齊的中國對蝦, 在實驗用水泥池中暫養7d, 暫養期間保證每天換水清污, 24h充氧泵連續充氧, 按時投喂。實驗用水為凈化后的海水, 水溫為(20—22)℃, 鹽度為26—28,pH為8.14—8.20。

1.2 實驗方法

總RNA的提取及cDNA的合成挑選活力好的中國對蝦, 每3尾為一組, 分別取鰓、肝胰腺、眼柄、肌肉、胃、心臟和腸道樣品, 共取3組, 迅速放入液氮中保存。組織處理使用全自動樣品快速研磨儀(凈信, 上海), 樣品總RNA的提取使用TRI-zol up試劑, 檢測RNA的質量和濃度使用NanoDrop 2000核酸定量儀(Tnermo, 美國), 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 使用反轉錄試劑盒(諾唯贊, 南京)將RNA反轉錄為cDNA, 5′和3′端RACE模板使用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit(寶生物, 大連)合成。

FcGs基因全長克隆Gs基因序列從本實驗室前期測得的中國對蝦轉錄組中獲得。Gs基因的全長序列的獲得利用RACE擴增技術。本實驗所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 1)。

表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers used in the study

基因序列生物信息學分析5′和3′端擴增序列與轉錄組序列的拼接使用Contig Express; 查找基因的開放閱讀框使用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/); 分析物種間的同源性使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi); 對多個物種該基因編碼氨基酸序列進行多序列比對使用DNAMAN軟件; 構建N-J進化樹使用MEGA 6軟件; 預測信號肽使用SignalP-5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 預測蛋白質結構域和蛋白質特性使用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)和ExPASy ProtParam(http://web.ex-pasy.org/protparam/)。

FcGs基因組織表達及處理組實時定量分析由FcGs基因cDNA全長序列設計qRT-PCR引物Gs-F和Gs-R, 內參基因選擇18S-F和18S-R(表 1)。FcGs基因的組織表達、處理組表達變化及篩選干擾靶點所用試劑為ChamQTMSYBR?Color qPCR Master Mix(諾唯贊, 南京), 所用儀器設備為7500 Fast Real Time PCR System(ABI, 美國)。

急性低鹽脅迫實驗及DA、cAMP、PKA、Gs含量和AC、Na+-K+-ATPase活力測定隨機選150尾規格整齊活力好的中國對蝦, 放在120 L的養殖箱。本實驗分別設置對照組和急性低鹽脅迫組, 鹽度分別為26和10, 設置25尾/平行, 每組3個平行。每6h用淡鹽水進行一次鹽度校正。

取樣時間分別是實驗開始后6h、12h、24h、48h和72h, 取0.2 g鰓組織樣品, 加入1∶9的預冷生理鹽水, 超聲波冰浴破碎組織, 4℃ 4000×g離心20min后取上清液放在-80℃冰箱保存。使用南京建成生物工程研究所和上海酶聯生物科技有限公司生產的試劑盒進行檢測, 檢測方法參照試劑盒附帶說明書。

siRNA干擾實驗基于FcGs基因cDNA全長序列, 設計G1、G2和G3共3個干擾靶點(表 2)。設置預實驗, 選出干擾效果最佳的siRNA靶點。正式實驗設置干擾組和對照組(NC), 在第二腹節肌肉進行注射, 標準為1 μg/g。統計實驗開始后48h內中國對蝦的累計死亡率。在注射12h、24h和48h時每組隨機選取3尾蝦取鰓組織樣品, 放于液氮中。

表2 本研究所用siRNA序列與NC序列Tab. 2 The sequences of siRNA and NC

2 結果

2.1 FcGs基因序列分析

FcGs基因全長1692 bp, 開放閱讀框(ORF)長度為1140 bp, 5′非編碼區(5′-UTR)和3′非編碼區(3′-UTR)長度分別為256和296 bp, 編碼379個氨基酸。FcGs基因編碼的蛋白分子量約為44 kD, 不穩定系數為46.86, 親水性平均值為-0.583, 脂肪系數為80.53, 理論等電點(pI)為7.12, 包括一個功能結構域,為無信號肽的非分泌蛋白, 蛋白結構為不穩定親水蛋白。

2.2 FcGs基因同源性分析

將中國對蝦與其他物種FcGs基因的氨基酸序列進行多序列比對并構建進化樹。分析得出中國對蝦FcGs基因與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)和日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)同源性較高, 分別為99%和97%。進化樹分為脊椎動物和無脊椎動物兩大支, 中國對蝦歸于無脊椎動物節肢動物門甲殼綱, 與凡納濱對蝦首先聚為一支, 其次為日本囊對蝦(圖 1)。

圖1 基于FcGs基因氨基酸序列構建的NJ進化樹Fig. 1 NJ tree based on FcGs amino acid sequences

2.3 FcGs基因在不同組織表達分析

利用RT-PCR分析FcGs基因在中國對蝦7個組織中的表達(圖 2)。結果顯示鰓表達量顯著高于其他組織(P＜0.05)。

圖2 FcGs基因在中國對蝦不同組織中的表達Fig. 2 The relative expression of FcGs in different tissues of Fenneropenaeus chinensis

2.4 FcGs基因在急性低鹽脅迫下鰓組織中的表達分析

分析FcGs基因在急性低鹽脅迫后鰓組織中的表達 (圖 3)。與對照組相比, 實驗72h內FcGs基因整體呈上調表達, 并顯著高于對照組(P＜0.05)。在12h時表達量達到最高值, 為對照組的2.019倍。

圖3 FcGs基因在中國對蝦鰓組織中表達情況Fig. 3 The relative expression of FcGs in gill tissues of Fenneropenaeus chinensis

2.5 急性低鹽脅迫對中國對蝦DA、Gs、cAMP和PKA含量的影響

在急性低鹽脅迫下中國對蝦鰓組織中DA、Gs、cAMP和PKA含量與對照組相比整體呈現上調表達趨勢(圖 4), 并顯著高于對照組(P＜0.05)。在實驗12h時達到最高值, 分別為對照組的1.256倍、1.449倍、1.359倍和1.202倍。

圖4 急性低鹽脅迫對中國對蝦cAMP信號通路內DA含量、Gs含量、cAMP含量和PKA含量的影響Fig. 4 Effects of acute low-salinity stress on DA, Gs, cAMP and PKA content of cAMP signaling pathway in Fenneropenaeus chinensis

2.6 急性低鹽脅迫對中國對蝦AC和Na+-K+-ATPase活力的影響

在急性低鹽脅迫下中國對蝦鰓組織中AC和Na+-K+-ATPase活力與對照組相比整體呈現上調表達趨勢(圖 5), 并顯著高于對照組(P＜0.05)。在12h時達到最高值, 分別為對照組的1.488倍和1.507倍。

圖5 急性低鹽脅迫對中國對蝦cAMP信號通路內AC活力和Na+-K+-ATPase活力的影響Fig. 5 Effects of acute low-salinity stress on AC and Na+-K+-ATPase activities of cAMP signaling pathway in Fenneropenaeus chinensis

2.7 FcGs基因干擾實驗

篩選干擾靶點利用RT-PCR分析干擾FcGs基因后該基因在鰓組織的相對表達量, 不同靶點的干擾效果有所差異(圖 6)。與對照組相比注射G1靶點后在12h、24h和48h后基因表達量分別為對照組的0.747、0.732和0.822倍, 而注射G2和G3后則分別是0.701、0.938和0.684倍, 以及0.599、0.559和0.720倍。在3個靶點中G3干擾效果最好, 選擇G3干擾靶點進行后續實驗。

圖6 注射G1、G2和G3后FcGs基因在中國對蝦鰓組織中的表達Fig. 6 Expression of FcGs gene in gill after G1, G2 and G3 injection

siRNA干擾FcGs后死亡率對中國對蝦的FcGs基因進行干擾并進行急性低鹽脅迫, 統計脅迫48h內的死亡率(圖 7)。干擾組48h內累積死亡率(32%)顯著高于對照組(16%)(P＜0.05)。

圖7 急性低鹽脅迫下注射siRNA干擾的中國對蝦的累計死亡率Fig. 7 Mortality stress of Fenneropenaeus chinensis after acute low-salinity and siRNA interference

3 討論

Gs基因與調節離子通道和滲透壓調節有關, 本次實驗通過RACE擴增技術得到中國對蝦FcGs基因cDNA全長序列, 同源性分析發現該基因編碼的氨基酸序列在物種間同源性較高, 具有Gs基因的典型序列結構和特征, 表明該蛋白在物種間具有較高的保守性。FcGs基因在中國對蝦鰓和肝胰腺中表達量較高, 鰓在調節滲透壓和離子轉運方面起重要作用[24,25], 是水環境發生變化后主要的調節器官[26];肝胰腺具有排毒與解毒的作用, 是重要的免疫防御器官[27,28]。由此推測FcGs基因參與中國對蝦滲透壓調節以及免疫防御過程。

鹽度是中國對蝦養殖中重要的環境因子[29—31],為進一步了解FcGs基因及其所在的cAMP信號通路是否在中國對蝦滲透壓調節過程發揮作用開展本次實驗。通過實驗發現在鰓組織中各項酶活和含量基本都在12h達到最高值, 說明鰓組織在實驗12h時滲透壓調節能力達到最大, 與在三疣梭子蟹中[5]的研究結果和在克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)中[32]的研究結果一致。在本實驗中, 急性低鹽脅迫后中國對蝦體內Gs基因表達與Gs含量顯著上調, 上游DA含量上升, 下游cAMP和PKA含量及AC和Na+-K+-ATPase活力上升, 與三疣梭子蟹[5]的研究結果一致。在推測急性低鹽脅迫下cAMP信號通路在滲透壓調節過程中調控路徑為DA→Gs→AC→cAMP→PKA, 通過調控下游Na+-K+-ATPase活力, 參與中國對蝦滲透調節過程。

通過對急性低鹽脅迫下FcGs基因進行干擾, 統計其48h內累積死亡率發現中國對蝦干擾組死亡率顯著高于NC組(P＜0.05), 說明FcGs基因的表達影響了中國對蝦的存活, 急性低鹽脅迫下中國對蝦FcGs基因的表達有利于中國對蝦的存活。干擾中國對蝦FcGs基因后基因表達量降低, 死亡率升高,推測FcGs基因在急性低鹽脅迫下的滲透壓調節過程中發揮重要作用。

Gs是cAMP信號通路中的一個重要的結合蛋白, 對于調控下游基因具有重要的作用。通過對中國對蝦FcGs基因的克隆, 并對該基因的功能進行了初步的推測。初步明確了Gs基因在中國對蝦鹽度適應過程中的作用, 為水生甲殼動物的在受到鹽度脅迫后的環境適應性調控機制提供基礎數據, 有助于解析中國對蝦鹽度適應機制, 也為選育抗逆新品種提供一定的理論依據和數據支撐。