農田微塑料對水稻秸稈分解及微生物活性的影響

秦宇輝，李 芬，肖佳敏，林永慧，何興兵

(吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000)

【研究意義】微塑料主要是指粒徑小于 5 mm 的塑料顆粒[1]。微塑料廣泛分布于生態環境中，目前對于水生生態系統微塑料的污染已經得到廣泛且深入的研究，陸生生態系統尤其是與人類生活生產息息相關的農田土壤近年來逐漸引起人們的關注[2]。水稻是南方農田種植的重要農作物之一，水稻秸稈是農田土壤微生物的主要養分來源。研究表明，微塑料能夠通過影響微生物活性從而影響水稻秸稈分解，微塑料影響秸稈分解的同時會受到外界因素作用而分解成更小的顆粒，因此研究土壤微塑料對水稻秸稈的分解過程具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】微塑料存在于土壤中，能影響土壤微生物。Machado 等[3]的研究發現微塑料通過影響土壤持水量，團聚體從而影響到土壤微生物，Wan 等[4]研究發現地膜碎屑能增加土壤水分蒸發速率，大顆粒微塑料對水分蒸發速率的影響小于小顆粒微塑料。濃度為 0.1～1.0 mg/kg的PS微塑料使得土壤微生物量顯著增加[5]，而1%～20%的PE與PVC微塑料使土壤微生物量有所增加[6]。Machado 等[7]研究了多種微塑料影響土壤微生物活性，PA、PE和PES增加了微生物活性，而其他類型的微塑料對微生物活性影響不顯著。Yi 等[8]研究了微塑料形狀影響微生物活性，纖維狀PP對土壤脲酶的影響大于碎片狀PE及顆粒狀PP微塑料，而碎片狀PE對土壤脫氫酶的影響大于顆粒狀及纖維狀PP微塑料。土壤中微塑料的分解取決于多種因素，微塑料本身的物理結構、環境溫度濕度、土壤微生物等都能對微塑料分解產生一定影響，Sudhakar 等[9]研究發現微生物能通過產生水解酶和氧化還原酶從而加速PE的降解?！颈狙芯壳腥朦c】微塑料污染農田土壤環境日益嚴重，微塑料影響微生物活性以及微塑料自身的分解趨勢是不確定的，基于此研究農田微塑料參與秸稈分解所形成的土壤綜合分解效應?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過分析不同種類、濃度、粒徑的微塑料存在的土壤對水稻秸稈分解過程微生物活性的影響以及微塑料殘余粒徑的分布范圍，采用 PCA 分析進一步分析水稻秸稈分解過程中各響應變量與微塑料處理之間的關系，為后續研究農田土壤微塑料的生態效應提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗樣地概況

實驗樣地位于湖南省衡陽市衡南縣西南部，該地區屬亞熱帶季風氣候，四季分明，多為丘陵地帶。水稻田是我國南方最重要的農業土壤之一，水稻收割后大量秸稈在土壤中進行分解。該地區水稻田的生境已經維持了長久的年月，形成了穩定的生態環境。在早春天氣寒冷時，水稻育苗需要用到塑料薄膜，或者是種植一些經濟作物，需要用塑料薄膜保溫或者是減少病蟲害等，所以留下了為數不少的塑料薄膜,農村的垃圾(包括塑料)大部分依舊處于亂扔亂焚燒狀態，這些塑料也會部分轉化為微塑料進入農田，進而可能對土壤性質以及秸稈分解等產生不同程度的影響。

1.2 材料

1.3 實驗設計

1.3.1 微塑料 根據已有的有關微塑料研究[10]，選取較為常見的微塑料種類聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)，以不同濃度的微塑料添加量(1%和5%)研究不同種類塑料濃度對秸稈分解的影響。另外選擇PE和PP，以小粒徑(250～180 μm，S),中粒徑(425～250 μm，M)和大粒徑(600～425 μm，L)等不同的粒徑研究不同種類塑料濃度對秸稈分解的影響(表1)。

表1 秸稈分解實驗所涉及的微塑料

1.3.2 水稻秸稈分解實驗設計 每組間隔約40 cm，每組5個重復，每個取樣點要確保能夠放置3個取樣的尼龍網袋。將土壤進行采集，去除較大的石頭及雜質，按照實驗方案的要求將相對應的種類、粒徑、添加量的微塑料加入到原生土壤中，混合均勻后，將泥土放入樣方中，讓尼龍網袋中的秸稈被泥土充分覆蓋。實驗持續6個月，2019年4—10月[10]，每3個月取1次樣，每次取樣65袋。

1.4 測定指標與方法

樣品取回實驗室后置于 4 ℃ 冰箱中暫時保存，以便于測定秸稈干濕重及相應的微生物活性。實驗周期結束，取土樣，以便于測定微塑料粒徑的變化。

微塑料粒徑變化的測定：參照Huerta Lwanga的方法[11]，在實驗周期結束之后，收集土樣，分析兩種塑料不同粒徑在分解期結束后殘余微塑料粒徑分布范圍。土壤在50 ℃ 烘干，取10 g干土加入燒杯中，添加純水，輕輕攪拌，使微塑料顆粒漂浮，每個土樣進行3～5次漂浮實驗。將收集的微塑料用純水沖洗幾次，除去表面附著物，之后進行干燥，通過30目(600 μm)、40目(425 μm)、60目(250 μm)、80目(180 μm)、100目(150 μm)5種不同大小的篩子，確定分解后的微塑料粒徑大小范圍。

失重率的測定：仔細清理取回樣品中的 3 袋秸稈表面的沙粒及根系，以便于進行濕重稱量，然后將其置于50 ℃ 烘箱中烘干至恒重，再稱量每袋秸稈樣品中凋落物的干重，用于秸稈失重率的計算[12]。

CO2釋放量的測定[12]：稱取 0.5 g 秸稈置于已滅菌的離心管中，將其置于裝有10 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液的無菌錐形瓶中并密封瓶口，放置在25 ℃黑暗條件下培養 48 h，然后用 0.05 mol/L HCl 進行滴定。

秸稈分解酶活性采用先提取粗酶液后用紫外可見分光光度計測定酶活性，纖維素酶活性和淀粉酶活性分析均采用二硝基水楊酸法測定[13-15]，木質素酶酶活性分析采用鄰聯甲苯胺法測定[16]。

1.5 數據分析

采用 Microsoft Excel 2010 軟件對實驗數據進行統計作表，數據表示為平均值±標準誤。為確定不同微塑料處理對于秸稈分解的影響，采用混合效應模型(mixed-model ANOVA，SPSS 16.0)，對固定效應以及樣方的隨機效應進行分析。如果固定效應或交互作用顯著，分別對前、后兩時期不同處理之間的變量進行方差分析(采用 Duncan 多重比較法分析兩兩之間的差異性，顯著性水平設定為 α=0.05)。為深入探討微塑料對后續秸稈分解過程的影響，運用 R 軟件(3.2.2)中的 Vegan 包進行影響因素與響應變量關系的主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

參考已報道的方法[16]并稍做調整合成復合材料c-MWCNT-MNPs。稱取0.2 mg的羧基化多壁碳納米管粉末于50 mL內含磁攪拌子燒杯中，加入1.8 g乙酸鈉和0.7 g FeCl3·H2O，再量取40 mL乙二醇倒入其中，進行磁力攪拌，攪拌30 min，將溶液裝入100 mL聚四氟乙烯內膽高溫反應釜中，200 ℃下反應12 h。待充分反應結束后，冷卻至室溫，將內膽中的上清液棄丟，其殘留黑色沉淀物用水來回超聲清洗5次，之后再用無水乙醇來回超聲洗滌5次，用玻璃瓶收集沉淀物，在 60 ℃水浴下利用旋轉蒸發儀進行干燥，去溶劑，得到黑色粉末物質即復合材料磁性羧基化多壁碳納米管，實驗備用。

2 結果與分析

2.1 微塑料粒徑分析

比較2種微塑料的3種粒徑在實驗周期結束后殘余微塑料的粒徑分布范圍(表2)，S、M、L表明實驗初始微塑料粒徑大小范圍分別為250～180、425～250、600～425 μm，對于PE(S)、PE(M)、PE(L)3種粒徑，分別有66%、74%、80%左右的微塑料分解為更小的微塑料顆粒，粒徑較大的相比較粒徑較小的分解程度較大。對于PP(S)、PP(M)、PP(L)3種粒徑，分別有70%、81%、91%左右的微塑料分解為更小的微塑料顆粒，粒徑較大的微塑料粒徑同樣分解程度較大。對于相同初始粒徑范圍的PE與PP，實驗結束后，PP粒徑的分解程度大于PE。

表2 水稻秸稈分解實驗結束后殘余微塑料的粒徑分布范圍

2.2 微塑料對水稻秸稈失重率的影響

混合線性模型分析結果表明，在考慮樣方隨機效應顯著的前提下，秸稈的失重率在不同微塑料處理間表現出差異性顯著(表3～4，P<0.05)。

表3 水稻秸稈分解過程中微塑料處理固定效應的分析

如圖1所示，在分解前期，低濃度PE、高濃度PP和高濃度PVC增加了秸稈失重率，中粒徑和大粒徑PE、小粒徑和大粒徑PP增加了秸稈失重率。分解后期，高濃度下PP和PVC增加了秸稈失重率，不同粒徑下PP均增加了秸稈失重率，大粒徑PP降低了秸稈失重率。分解后期失重率普遍高于分解前期。

表4 水稻秸稈分解過程中微塑料處理隨機效應的分析

不同字母表示不同處理在0.05水平上的差異顯著性，下同

2.3 微塑料對水稻秸稈分解CO2釋放量的影響

混合線性模型分析結果顯示，在考慮樣方隨機效應顯著的前提下，秸稈的CO2釋放量在不同微塑料處理間仍表現出差異顯著，并且在分解時期與微塑料處理間的交互作用也顯著(表3～4，P<0.05)。

CO2釋放量在一定程度上反映了分解者呼吸代謝的狀態。如圖2所示，在秸稈分解前期，隨著PE濃度增加秸稈的CO2釋放量減少，而PP與PVC濃度增加秸稈的CO2釋放量增加，PE粒徑增加CO2釋放量逐漸減少。分解后期，隨著PE濃度增加秸稈的CO2釋放量增加，而PP與PVC濃度增加時秸稈的CO2釋放量逐漸減少。

圖2 微塑料對水稻秸稈分解前期和后期CO2釋放量的影響

2.4 微塑料對水稻秸稈分解酶活性的影響

在考慮樣方隨機效應的前提下，固定效應分析結果顯示，5種分解酶在不同微塑料處理間的差異均具有統計學意義(P<0.05)，且交互作用顯著(表3～4)，因此需要對不同分解期各酶活在不同微塑料處理之間的差異顯著性進行分析。

纖維素是秸稈的主要有機組分之一，其主要降解酶包括外切β-葡聚糖苷酶(Exo-1,4-β-glucanase，C1酶)及羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，Cx酶)。如圖3所示，在秸稈分解前期和后期，微塑料多數提高Cx酶的活性，且隨著濃度增加，酶活性增加。圖4顯示秸稈分解前期和后期，微塑料抑制了C1酶活性，濃度增加，抑制作用越強。另外，分解前期Cx酶和C1酶活性高于分解后期。

圖3 微塑料對水稻秸稈分解前期和后期Cx酶活性的影響

圖4 微塑料對水稻秸稈分解前期和后期C1酶活性的影響

淀粉酶(包括α-淀粉酶和β-淀粉酶)是淀粉水解酶，一般滿足于先鋒分解者以及機會主義分解者的生長代謝需求。如圖5所示，分解后期，微塑料濃度增加，α-淀粉酶活性降低，粒徑不斷增大，α-淀粉酶活性增加。圖6顯示分解前期，微塑料對β-淀粉酶起抑制作用；微塑料濃度越高，抑制作用越強。分解后期，微塑料多數對β-淀粉酶起促進作用，粒徑不斷增大，酶活逐漸減少。分解前期α-淀粉酶與β-淀粉酶普遍高于分解后期。

圖5 微塑料對水稻秸稈分解前期和后期α-淀粉酶活性的影響

圖6 微塑料對水稻秸稈分解前期和后期β-淀粉酶活性的影響

木質素在秸稈分解過程中與失重率密切相關，通常被看作是影響秸稈分解的關鍵因素之一，而過氧化物酶是木質素主要分解酶之一。如圖7所示，分解前期，微塑料對過氧化物酶活性起促進作用，酶活性隨PE與PP濃度增加而逐漸減少，但隨PVC濃度增加而增加。分解前期過氧化物酶活性普遍低于分解后期。

圖7 微塑料對水稻秸稈分解前期和后期過氧化物酶活性的影響

2.5 主成分(PCA)分析

為進一步分析秸稈分解過程中各響應變量與微塑料處理之間的關系，采用PCA法進行分析。如圖8所示，在秸稈分解前期和后期間，PC1分析分別解釋了 30.94%和32.35%的總方差，PC2分別解釋了23.53%和21.47%的總方差。在分解前期，α-淀粉酶、β-淀粉酶和失重率有較好的關聯性，PE(M)、PE(L)、PP(S)、PP(M)對失重率起正面作用。在分解后期，β-淀粉酶和Cx酶和失重率有較好的關聯性，PE(S)、5%PP、5%PVC對失重率起正面作用。

圖8 水稻秸稈分解前期和后期失重率、CO2釋放量及微生物酶活性的主成分分析

3 討 論

(1)通過分析PE和PP的殘余微塑料粒徑分布范圍，發現微塑料都有大幅度分解成小顆粒的趨勢。同一種類的微塑料，大粒徑微塑料分解程度大于小粒徑微塑料，相同初始粒徑范圍的不同微塑料，PP的分解程度大于PE的分解程度。太陽光的紫外輻射能量能高效地破壞塑料高分子結構，然而在土壤中微塑料分解只能依靠于土壤微生物[17]、土壤動物[18]等，土壤生物影響微塑料的分解是一個漫長的過程，因此本研究中推動微塑料分解最密切的因素可能是由于不同微塑料的結構特性有所不同，大粒徑的微塑料相比小粒徑微塑料，穩定性較差，同為高分子化合物的PP與PE相比，PP穩定性較差[19]。

(2)在微塑料處理后，多數水稻秸稈的分解率有一定程度增加，不同種類的微塑料對秸稈分解促進效果存在差異，PP與PVC促進效果較為顯著，而PE促進效果不顯著，失重率多數隨著微塑料濃度增加而增大，隨著塑料粒徑增大而減少。推測是因為微塑料能成為某些微生物的獨特棲息地[20-21]，可以有效減緩微生物或微生物分解酶在土壤中受到外部環境的影響，不同的微塑料結構差異導致其對微生物促進效果存在差異[19]。在一定濃度范圍內，高濃度的顆粒狀微塑料相比較于低濃度顆粒狀微塑料，能為微生物提供更多的有利生存環境，對微生物活性產生正面影響[22]，小粒徑的微塑料相比大粒徑的微塑料，有更大的比表面積，更有利于微生物的生存[23]。

(3)從分解前期到分解后期秸稈累積失重率是增大的，但是失重率增大的幅度變緩了非常多，這可能是由于參與秸稈分解的微生物大多數依賴易獲得的淀粉、纖維素等[24]。分解后期木質素含量增加，增加了分解難度，同時微生物分解前期的生物量擴展抑制了木質素分解菌活性，這些潛在因素降低了秸稈后期的分解速率，這與大多數研究的秸稈分解趨勢相同[25-26]。微生物產生的分解酶，是秸稈分解的最直接驅動力，微塑料對Cx酶起到促進作用，高濃度微塑料促進效果高于低濃度微塑料。微塑料對C1酶起到抑制作用，微塑料濃度越高，抑制效果越明顯。另外，微塑料對α-淀粉酶和β-淀粉酶的影響具有一定的不確定性，而對過氧化物酶起到促進作用。不同微塑料結構存在差異，影響微生物繼而導致酶活會有差異[21]，但本研究未能發現酶活因微塑料種類不同有明顯規律性差異；纖維素分解酶Cx酶與微塑料濃度成正比，而纖維素分解酶C1酶與微塑料濃度成反比；同等質量的微塑料，粒徑越小能提供更多的比表面積[23]，然而本研究中未能體現酶活因粒徑大小不同存在顯著的變化規律。微塑料基于種類、濃度、粒徑對于秸稈分解酶的影響存在不確定性。

本研究中PCA 分析顯示秸稈分解前期，α-淀粉酶、β-淀粉酶和失重率有較好的關聯性，并且分解前期α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性遠大于分解后期這兩種酶的活性，說明在分解前期，分解纖維素的微生物與 α-淀粉酶和β-淀粉酶有密切的關聯，在分解前期，小粒徑PP,中粒徑PE和PP及大粒徑微塑料均對失重率有促進作用，粒徑有關的因素對失重率影響較多，我們推測可能是纖維素分解菌受到不同粒徑的微塑料的影響比較明顯[27]。秸稈分解后期的過氧化物酶活性遠大于分解前期，反映了在分解后期，分解木質素的真菌開始發揮作用，分解后期，PCA分析顯示失重率并未和過氧化物酶有較好的相關性，可能是與過氧化物酶相關的木質素分解菌剛開始發揮作用不久，沒有對木質素產生大幅度降解。分解后期，5%PP、5%PVC 對失重率有促進作用，較高濃度有關的因素對失重率影響較多，可能是木質素分解菌受到不同濃度的微塑料的影響比較明顯[21]。

4 結 論

微塑料對水稻秸稈分解起促進作用，因此微塑料在某種程度上促進了農田生態系統的物質能量循環。本研究中影響微塑料分解的最密切因素來自于微塑料本身的結構特性，對于其他復雜的土壤環境，需要考慮多因素共同作用對微塑料分解的影響。因此，土壤微塑料在農田生態系統中扮演著重要角色，本研究能為進一步研究微塑料的綜合土壤效應提供參考依據。