不同梯度氮磷鉀施用量對云南植煙土壤細菌群落結構與多樣性的影響

王志遠，阮彥楠，王 偉，陳檢鋒，趙文軍，陳 華，付利波

(1.云南省農業科學院農業環境資源研究所，昆明 650205；2.昆明學院，昆明 650205；3.紅塔煙草(集團)有限責任公司原料部，云南 玉溪 653100)

【研究意義】煙草是中國的一種重要經濟作物，其在經濟發展中起著關鍵作用。云南省是中國主要煙草產區之一，煙草也逐步成為云南省的一個支柱產業[1]。相關研究表明，合理的施肥措施是提高煙葉產量和品質的關鍵核心技術，在一定的生態環境和品種條件下，合理施肥能提高煙葉地上部分有機物的合成量，形成合理的C/N比[2-3]，因此掌握煙草合理的施肥措施，是提升云南省煙草產量和品質的重中之重。【前人研究進展】云南植煙土壤因長期的不合理的施肥方式造成了云南植煙土壤的一系列生產問題，特別是造成了土壤養分失調、土壤生物代謝過程受阻等問題抑制了烤煙生長，從而導致煙葉品質下降。可以看出長期不合理施肥嚴重影響云南省烤煙生產的可持續發展[4-6]。王日俊等[7]研究表明，合理施肥能使烤煙的平均產量增加4.68%，并顯著提升了上等煙葉比例13.55%，所以合理的施肥措施可以提高煙葉產量和品質。土壤微生物是土壤生態過程的核心和重要組成部分，在Balvanera等[8]的研究中，微生物的多樣性對大多數的生態系統有積極的影響，包括在土壤生態系統中。土壤微生物結構和功能可以有效地反映土壤質量的變化、衡量土壤可持續發展，是評價土壤質量及土壤生態系統可持續發展的重要指標[9]。Fierer等[10]發現，土壤微生物可以增加土壤肥力，提高作物的產量，并改善陸地生態系統。土壤微生物在土壤有機物質的轉化分解[11]、養分元素的循環與利用[12]、土傳病害抑制等方面發揮著重要的作用。在Hartmann[13]的研究中，采用有機耕作和施肥的方式可以提高土壤微生物的豐富性，增加有機質的分解和土壤肥力，并改變了土壤微生物群的結構。土壤微生物是土壤肥力的關鍵驅動因子，前人研究發現長期合理施肥和土壤管理增加土壤細菌多樣性，改善了土壤養分質量，支持了富營養化生態系統[14]，因此土壤微生物群落結構和功能多樣性信息對于揭示科學施肥措施與土壤肥力和作物生產力提高的作用機制具有重要意義。【本研究切入點】通過16S rRNA 高通量測序技術能檢測土壤樣品中微生物群落組成及其相對豐度，相較于傳統的微生物多樣性研究方法，高通量測序技術具有測出的數據量大、速度快，能夠直接反映出土壤DNA的豐度，低成本等優勢[15]。【擬解決的關鍵問題】本研究通過研究不同施肥條件下煙田土壤中細菌群落結構組成差異，試圖從土壤微生物多樣性的角度解釋不同施肥處理下土壤細菌群落結構的變化，以期為云南省煙草產區土壤的可持續耕作管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地于2019年在云南省澄江縣龍街鎮后香村(東經102°52′55″，北緯24°38′58″)，海拔1698 m。供試土壤為水稻土，試驗烤煙品種為當地主栽品種K326，種植規格為行距120 cm，株距60 cm。試驗所用肥料：氮肥為硝酸銨鈣(含N 15.5%)，磷肥為過磷酸鈣(含P2O516%)，鉀肥為硫酸鉀(含K2O 50%)。

1.2 試驗設計

在種植烤煙前，將同一試驗地分為3個大區，每個大區700 m2，試驗前對大區進行裂區處理，每個大區裂為10個小區，設置10個處理(表1)，采用隨機區組分別設置3次重復，其他生產技術按照當地農業部門推薦技術操作。

表1 試驗設計

1.3 土壤樣品采集

2019年在云南省澄江縣龍街鎮后香村烤煙實驗田采集煙葉收獲后(70 d)土壤樣品，采樣時去除表層0～2 cm的土壤，拔出煙株，收集粘附在根系上的0～4 cm的土壤，再分別對每個小區隨機取5個煙株樣點混合為1個樣品，低溫下保存并及時運回實驗室。將采集的土壤樣品過10 mm篩，去除試驗土壤中的煙草根系殘體和未分解完全的秸稈殘體，再將處理好的土壤放入取樣袋中，于-80 ℃低溫冰箱下保存待用。

1.4 土壤樣品總DNA提取和16S rRNA的PCR擴增

1.4.1 土壤樣品總DNA提取 土壤總DNA使用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)試劑盒進行土壤DNA提取，提取步驟依照試劑盒說明進行，每樣品3次平行，將已提取的DNA保存在-20 ℃冰箱內以待后續測試。

1.4.2 細菌16S rRNA的PCR擴增 以提取的土壤微生物總DNA為模板，將細菌16S rRNA基因在V3～V5區的特異性基因經PCR擴增，并將擴增的產物克隆到載體上，對陽性克隆子進行挑選培養并測序；所得序列與NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行同源性比對分析，用紫外分光光度計測定其DNA濃度，制成標準品。用無菌水稀釋標準品至1 ng/μL，并將其作為模板放在熒光定量儀上進行PCR擴增，建立反映定量PCR的Ct閾值與質粒拷貝數濃度對應的標準曲線。通過檢測不同處理DNA樣品經PCR擴增后得到的Ct值，進而得出特異性基因片段拷貝數目。

1.5 數據統計與分析

1.5.1 微生物數據分析 通過軟件 UCULT(3.1.0)對獲得的每個樣品16S rRNA 有效序列比對結果并進行聚類，將相似度>97%的有效序列歸為同一個 OTU(Operational taxonomic units，操作分類單位)。對得到的OUT數據集基于 R 3.6.3 軟件的phyloseq包和microbiome包進行細菌群落多樣性分析。α多樣性指數可以反映土壤微生物群落變化和物種的豐度和多樣性[16]。土壤中觀測到的細菌OTU數量，可以描述土壤中檢測到的細菌物種的豐度，Shannon 指數可以描述土壤中微生物群落的多樣性，指數越小群落的物種多樣性越小，反之則越大，Simpson 指數可以描述土壤微生物群落中常見的物種優勢程度，即物種均勻度[17-18]。本研究中關注的α多樣性是指對物種多樣性進行分析,包括觀測到的OUT數量(Observed)、Simpson以及Shannon 3個指數[19-20]。通過以上3個指數評價煙田細菌的群落多樣性。

1.5.2 不同施肥處理的差異分析 通過線性模型檢驗不同施肥梯度下土壤細菌群落多樣性的差異效應及交互作用。P×K互作處理為氮施用量為90 kg/hm2時不同磷、鉀梯度，包括P0K2、P1K2、P2K0、P2K1、P2K2、P2K3、P3K2；N×K互作處理為磷施用量為45 kg/hm2時不同氮、鉀梯度，包括N0K2、N1K2、N2K0、N2K1、N2K2、N2K3、N3K2；N×P互作處理為鉀施用量為270 kg/hm2時不同氮、磷梯度，包括N0P2、N1P2、N2P0、N2P1、N2P2、N2P3、N3P2；其中P0=0 kg/hm2，P1=22.5 kg/hm2，P2=45 kg/hm2，P3=67.5 kg/hm2；K0=0 kg/hm2，K1=135 kg/hm2，K2=270 kg/hm2，K3=405 kg/hm2；N0=0 kg/hm2，N1=45 kg/hm2，N2=90 kg/hm2，N3=135 kg/hm2。采用的統計分析軟件為 R studio 3.6.3，所用的數據分析包為nlme。

2 結果與分析

2.1 不同氮、磷、鉀梯度下優勢細菌種群相對豐度比較

圖1表明，細菌在門水平上有21個種群，其中7個優勢種群(每個種群相對豐度>1%)依次為變形菌門(Proteobacteria)，酸桿菌門(Acidobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，綠彎菌門(Chloroflexi)，厚壁菌門(Firmicutes)。

圖1 不同氮、磷、鉀梯度下細菌門水平相對豐度

在氮梯度(N0、N1、N2、N3)處理中，變形菌門相對豐度分別為37.50%、39.51%、39.98%和40.05%，酸桿菌門為17.32%、12.74%、13.72%和14.42%，放線菌門為16.62%、17.93%、18.23%和16.92%，擬桿菌門為7.98%、9.37%、8.88%和9.56%，芽單胞菌門為7.37%、6.88%、6.95%和7.27%，綠彎 菌門為6.92%、6.79%、6.42%和5.66%，厚壁菌門為3.00%、2.88%、2.68%和2.91%；在不同氮梯度處理下，變形菌門，擬桿菌門和放線菌門相對豐度上升，分別上升至39.51%～40.05%、8.88%～9.56%和6.92%～18.23%；而酸桿菌門，芽單胞菌門，綠彎菌門和厚壁菌門相對豐度下降，分別下降至12.74%～14.42%、6.88%～7.27%、5.66%～6.79%和2.68%～2.91%。

在磷梯度(P0、P1、P2、P3)處理中，變形菌門相對豐度分別為46.40%、38.85%、39.98%和38.29%，酸桿菌門為13.20%、15.16%、13.72%和14.65%，放線菌門為15.68%、18.40%、18.23%和20.69%，擬桿菌門為9.34%、8.41%、8.88%和7.88%，芽單胞菌門為5.30%、6.30%、6.95%和6.75%，綠彎菌門為4.56%、6.19%、6.42%、5.99%，厚壁菌門為2.36%、3.52%、2.67%和3.00%；在不同磷梯度處理下，酸桿菌門，放線菌門，綠彎菌門，芽單胞菌門和厚壁菌門相對豐度上升，分別上升至13.72%～15.16%、18.23%～20.69%、5.99%～6.42%、6.30%～6.95%和2.67%～3.52%；而變形菌門和擬桿菌門相對豐度下降，分別下降至38.29%～39.98% 和7.88%～8.41%。

在鉀梯度(K0、K1、K2、K3)處理中，變形菌門相對豐度分別為40.94%、40.01%、39.98%和40.36%，酸桿菌門為17.67%、19.24%1、3.72%和17.03%，放線菌門為14.16%、13.19%、18.23%和14.13%，擬桿菌門為8.60%、9.54%、8.88%和9.83%，芽單胞菌門為7.27%、6.27%、6.95%和6.49%，綠彎菌門為6.20%、5.81%、6.42%和5.77%，厚壁菌門為1.88%、2.49%、2.67%和3.27%。在不同鉀梯度處理下，擬桿菌門，厚壁菌門相對豐度上升，分別上升至8.88%～9.83%和2.49%～3.27%；而變形菌門，芽單胞菌門相對豐度下降，分別下降至39.98%～40.36%和6.27%～6.95%；而在酸桿菌門，放線菌門和綠彎菌門中相對豐度有上升也有下降，但相對豐度也在0.22%～4.07%波動。

2.2 不同氮、磷、鉀梯度下細菌群落α多樣性指數

由圖2可知，不同氮梯度和不同鉀梯度條件對土壤細菌的3個多樣性指數的影響相較于不同磷梯度處理下影響較低。不同磷梯度條件下，在磷施用量為67.5 kg/hm2時，土壤微生物3個α多樣性指數分別為OUT=1494(P=0.067)，Shannon=5.98(P=0.016)和Simpson=0.9891(P=0.043)，顯著低于其他處理組；在不施磷處理的條件下各指數也相對較低，分別為OUT=1512(P=0.067)，Shannon=6.05(P=0.016)和Simpson=0.9919(P=0.043)。在磷施用量為45 kg/hm2條件下，觀察到OUT=1530(P=0.067)，數值最高；在施磷22.5和45 kg/hm2條件下，Shannon和Simpson指數差異不明顯。

圖中小寫字母表示處理間差異，*表示P<0.05，**表示P<0.1

2.3 不同養分互作條件下優勢種群變形菌門α多樣性比較

圖3表明，在N=90 kg/hm2的處理中，不同磷、鉀組合梯度下發現，磷、鉀不同養分梯度組合可顯著改變土壤優勢種群變形菌門的Shannon指數和Simpson指數；其中當磷和鉀(P2K3)的施用量分別為45和405 kg/hm2時，Shannon指數和Simpson指數分別為4.640(P=0.049)和0.967(P=0.053)，顯著低于其他處理組；當磷和鉀(P1K2)的施用量分別為22.5和270 kg/hm2時，Shannon指數和Simpson指數分別為4.87(P=0.049)和0.976(P=0.053)。在P=45 kg/hm2的處理中，不同氮、鉀組合梯度下，未發現顯著改變土壤優勢種群變形菌門的α多樣性指數的效應，但是當氮和鉀(N2K3)施用量分別為90和405 kg/hm2時，變形菌門的Shannon指數和Simpson指數分別為4.640(P=0.370)和0.967(P=0.444)，相對低于其他處理組。

圖3 不同養分互作條件下優勢種群變形菌門α多樣性

3 討 論

在自然生態系統中無人為干擾的條件下，土壤生物在維持土壤養分動態循壞平衡中發揮著重要的作用[21]。在農田生態系統中由于人類的集約化耕作措施的影響，想維持土壤中養分平衡，施用有機肥、無機肥或有機無機混合肥是最有效并快速補充土壤養分的重要方法[22]。化肥能為作物提供大量的N、P、K用于合成植物生長所需的營養物質，不同的施肥量往往對土壤中微生物的影響也不同，煙田施用肥料的種類和用量，均會對土壤性質和微生物群落組成和結構功能產生影響[23]。研究表明，氮和鉀對烤煙產量及品質具有非常重要的影響[24]，因此植煙土壤中氮和鉀通常殘留量很大；本研究雖然設置了不同量梯度的氮和鉀處理，可能由于殘留因素，不同氮和鉀梯度處理對土壤細菌3個多樣性指數影響表現無明顯差異，但不同磷梯度處理對土壤細菌3個多樣性指數的影響具有一定的差異。

土壤微生物多樣性與群落結構和生態功能穩定性之間總體上存在線性關系，一般情況下，土壤微生物豐度越高、群落組成結構越復雜，土壤微生態的功能穩定性越強[8]，不均衡的施肥會導致土壤有效養分失衡，生產力下降，從而抑制土壤微生物活性，不利于參與土壤養分循環的微生物繁殖，進而導致土壤微生物多樣性的下降[25]。土壤微生物豐度下降，導致土壤性質和土壤微生物群落對環境的應變能力降低、土壤微生態的穩定性下降，而當土壤微生物群落的豐度較高時，能夠“持有”和“表達”不同的功能過程，群落才能更好適應環境，進而維持其功能[26-27]。在本研究不同養分互作條件下優勢種群變形菌門α多樣性比較中，發現在N=90 kg/hm2的處理中，不同磷、鉀組合梯度可顯著改變土壤優勢種群變形菌門的Shannon指數和Simpson指數，說明在N=90 kg/hm2基礎上，磷、鉀的不同養分梯度均能顯著改變土壤微生物群落豐度。

通過研究不同施肥條件下煙田土壤中細菌群落結構組成差異，試圖從土壤微生物多樣性的角度解釋不同施肥處理下土壤細菌群落結構的變化。玉鈺等[28]研究表明，在煙田長期施用有機肥或有機無極混合肥會明顯提高土壤質量，增加土壤細菌豐富度，維持煙田土壤質量和微生物結構。反之，土壤微生物的組成結構和豐度也映土壤質量。微生物的群落豐度越高，土壤的物質代謝越快，土壤質量越好。有研究表明，土壤微生物群落多樣性與土壤養分含量呈正相關[29]，而土壤微生物的組成結構也反映土壤質量，在煙田土壤微生物組成中，細菌數量占絕對優勢，其次是放線菌，真菌數量最少[30]，本次試驗占比最多的細菌優勢門類為變形菌門(Proteobacteria)，酸桿菌門(Acidobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，綠彎菌門(Chloroflexi)，厚壁菌門(Firmicutes)，這些優勢群落占所有有效序列的90%以上，這與楊帥等[31]的在不同輪作方式下煙田土壤細菌群落組成類似。土壤真菌群落主要由子囊菌、擔子菌和接合菌構成，子囊菌為優勢菌群[32]。本次試驗未研究云南植煙土壤真菌群落結構與多樣性，但有研究表明，土壤真菌群落對烤煙產量有顯著的負效應，真菌群落豐度和群落多樣性對煙草有一定的負影響[33]。綜上所述，煙田合理的施肥制度能增加有益細菌并降低病原真菌的豐度和群落多樣性，這些復雜的土壤微生物組成結構和豐度共同作用于土壤物質代謝循環，反映土壤質量，最終影響煙草產量和品質。

試驗通過16S rRNA 高通量測序技術檢測云南植煙土壤微生物群落組成及其相對豐度，克服了傳統微生物多樣性研究方法的局限性，能更迅速、直接、低成本反映出土壤DNA的豐度[15]。這些研究有助于明確如何通過合理施肥來管理土壤微生物，增加土壤微生物群落多樣性，相關研究表明，適宜施肥方式可以有效改善煙田土壤微生物，穩定土壤結構和土壤微生態環境，提高煙草產量和品質[34]，最終促進種地與養地相結合的煙田資源可持續利用提供依據。

4 結 論

本研究表明，在煙草根際土壤中，不同梯度施用量的氮、磷、鉀在提高土壤養分的同時，也提高了土壤微生物的豐富度，氮、磷、鉀不同養分梯度組合顯著改變了土壤優勢種群變形菌門的多樣性。在煙田中不同施肥處理條件下土壤細菌域有7個優勢種群，依次為變形菌門，酸桿菌門，放線菌門，擬桿菌門，芽單胞菌門，綠彎菌門，厚壁菌門，這些優勢群落占所有有效序列的90%以上，相對于不同氮、鉀梯度施用量，不同磷梯度的養分用量對煙田土壤細菌群落的多樣性具有顯著影響。在不同梯度施肥作用條件下，施肥改變了土壤的主要化學性質，進而導致了土壤細菌群落結構的改變，合理的施肥制度能很好的保持土壤微生物群落生態系統，促進種地與養地相結合的煙田資源可持續利用。