生物有機肥調控的堿性植煙土壤微生物群落多樣性特征

濮永瑜，包玲鳳，楊佩文，沈廣材，張 慶，尹興盛，施竹鳳，裴衛華，劉月靜，楊光偉，楊明英

(1.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000；2.云南省農業科學院農業環境資源研究所，昆明 650205；3.云南省煙草公司文山州公司，云南 文山 663000)

【研究意義】施肥作為農業生產中維持土壤肥力、提高作物產量和質量的重要農藝措施，可通過改變土壤理化性質、生物學活性和土壤環境，塑造土壤微生物群落，影響作物生長發育[1]。然而現代農業生產中存在化肥過量施用和施肥模式不合理等現象，給土壤養分、耕地質量和微生物群落結構帶來巨大壓力[2]。為了緩解化肥長期施用造成的負面影響，通常采用添加有機肥來改善耕地質量，有機肥釋放的養分具有穩定持久的優點，更利于作物生長[3]。有研究表明，向耕地中添加有機肥替代部分化學肥料在農業可持續生產中具有巨大潛力[4]。【前人研究進展】土壤理化性質、養分含量和酶活性是評價土壤質量的關鍵指標，有機肥的添加可改善土壤理化性質和養分含量，提高土壤酶活性[5-6]。土壤微生物是土壤中最為活躍的部分，是衡量土壤質量的重要指標，直接或間接作用于土壤養分轉化和物質循環，對維持土壤生產力和健康起重要作用，參與了土壤質量演替的全過程[7-8]。有機無機配施的施肥模式不僅可以快速提升土壤肥力，改善作物品質，還可以緩解長期單施化肥導致土壤生態環境惡化這一問題[9]。添加不同有機肥土壤理化性質、酶活性、微生物多樣性和群落組成存在顯著差異。桑文等[10]研究發現，化肥減量10%配施液體有機肥可顯著提高番茄土壤肥力、改善微生物群落結構，營造一個良好的土壤微生態環境。王鵬等[11]研究表明，有機肥施用可有效提升山東煙區棕壤有機碳含量和酶活性。李銀科等[12]研究發現，施用牛糞的高粱土壤微生物量、酶活性和土壤微生物豐度顯著增加。因此，闡明生物有機肥輸入后土壤理化性質和微生物群落組成差異，對于優化烤煙栽培具有參考價值。【本研究切入點】近年來，關于生物有機肥對土壤理化性質的報道較多，但對微生物群落結構的影響，特別是對細菌和真菌類群的功能研究相對較少。為此，本研究設置植煙土壤耕作前、深耕后以及深耕單施化肥、深耕配施有機肥和深耕配施生物有機肥等處理，分析測試土壤主要理化性質、酶活性和微生物種群結構組成。【擬解決的關鍵問題】解析土壤主要理化性質和酶活性與微生物種群豐度間的關系，揭示深耕配施生物有機肥模式下植煙土壤微生物群落構建機制，為完善保山地區煙草產業高效合理施肥和農業可持續健康發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗設置在云南省保山市西邑鄉王寨村，99°18′15″E，24°58′34″N，海拔1620 m，年均溫17.2 ℃，年均降雨量969 mm，土壤類型為黃壤，試驗地作物種植模式為烤煙—蠶豆輪作。試驗設5個處理：植煙土壤耕作前(處理BP)、植煙土壤深耕后(處理PA)，深耕+化肥(處理CK)、深耕+化肥+有機肥(500 kg/hm2)(處理CN)、深耕+化肥+生物有機肥(4000 kg/hm2)(處理CS)，每個處理3次重復。化肥∶復合肥(8∶16∶26)900 kg/hm2+氮鉀肥300 kg/hm2；有機肥：農家肥發酵而成；生物有機肥：以菌渣、中藥渣和草炭為原料，經充分腐熟發酵后，添加微生物菌劑經二次發酵即得，其中，N 質量分數19.82 g/kg，P2O533.78 g/kg，K2O 29.26 g/kg，ω(C)/ω(N)為20.97，多粘芽孢桿菌有效活菌數 ≥ 2.0 億/g。全部的有機肥和生物有機肥作為基肥(環狀塘肥)施用，其它主要栽培技術參照當地烤煙標準化生產技術方案執行，烤煙品種云煙系列(云煙105)。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品采集 2020年10月烤煙收獲期按照常規取樣法取樣。五點取樣法取10～20 cm烤煙根際土，將5個點的土樣混合為一個樣本，挑出根系雜質，冰盒保存，帶回實驗室分為2份，1份過60目篩-80 ℃冷凍干燥，用于DNA提取；1份自然風干室溫儲藏，用于理化性質和酶活測定。

1.2.2 土壤理化指標測定 土壤容重(Bulk density，BD)：環刀法；土壤pH：pH 儀測定；有機質(Organic matter，OM)含量：重鉻酸鉀外加熱法測定；全氮(Total nitrogen，TN)含量：凱氏定氮法測定；堿解氮(Alkaline-ydrolyzed nitrogen，AN)含量：堿解擴散法測定；全磷(Total phosphorus，TP)含量：氫氧化鈉熔融—鉬銻比色法測定；速效磷(Available phosphorus，AP)含量：碳酸氫鈉提取法測定；全鉀(Total potassium，TK)含量：氫氧化鈉熔融—火焰光度法測定；速效鉀(Available potassium，AK)含量：鹽酸浸提-AAS法測定。土壤蔗糖酶(Invertase，INV)和脲酶(Urease，URE)活性采用試劑盒(蘇州瑞思公司生物科技有限公司)微板法測定，測定方法按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 土壤微生物高通量測序 采用OMEGA試劑盒提取土壤微生物總DNA，提取方法參照操作說明書進行。提取的DNA 溶液經NanoDrop ND-2000 分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA 的質量、濃度和片段長度。土壤樣本送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq測序，引物對應區域：16S V3～V4區[338F/806R(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’/5’-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3’)]；真菌ITS擴增引物序列為[ITS1F/ITS2R(5’-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAG G-3’/5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)]。采用Qiime 2(v2020.2)分析流程進行序列去噪或ASV(Amplicon sequence variants)聚類，Bayes分類器進行物種注釋，對比數據庫為silva138/16s-bacteria和unite8.0/its-fungi，根據ASV在不同樣本中的分布，評估每個樣本的Alpha多樣性水平。計算各樣本的距離矩陣，衡量不同處理間的Beta多樣性。根據16S rRNA測序結果，對土壤細菌進行BugBase表型預測，采用FUNGuild v1.0對土壤真菌進行FUNGuild功能預測，找出處理間的差異。

1.3 數據分析

通過上海美吉生物云平臺進行PCoA分析、RDA分析，采用Excel 2010、SPSS 20、SigmaPlot 12.5進行統計分析、方差分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 有機肥對土壤理化性質的影響

由表1可知，與處理PB相比，處理PA、CK、CN、CS土壤容重顯著降低(P<0.05，下同)，處理CK、CN、CS的pH、全鉀含量顯著降低，處理PA有機質、全磷、速效磷含量顯著降低，處理CK、CN、CS有機質、全磷、速效磷和速效鉀含量顯著提升。與處理CK相比，處理CN土壤pH、速效鉀降低；處理CS土壤pH、速效鉀含量顯著降低，有機質、全磷、速效磷含量顯著增加。

表1 植煙土壤主要理化性質

2.2 土壤酶活性變化特征

從圖1可見，蔗糖酶活性為45.36～64.81 d/(mg·g)，脲酶活性為0.39～2.06 d/(mg·g)。與處理PB相比，處理CN、CS蔗糖酶顯著提升，處理PA、CK、CN、CS脲酶顯著提升。與處理CK相比，處理CN、CS蔗糖酶和脲酶活性顯著增加。

圖1 不同處理植煙土壤酶活性分析

2.3 土壤微生物群落結構特征

2.3.1 微生物群落Alpha多樣性分析 土壤細菌16S rRNA、真菌ITS1基因高通量測序數據統計分析，分別得到Clean tags條數為205 725、630 030，基于≥97%的相似度水平，通過ASV劃分和分類地位鑒定，去重后得到ASV總數為4251、3764。與處理PB相比，處理PA細菌、真菌Chao1指數顯著降低，真菌Shannon指數顯著降低，細菌Shannon指數無顯著變化；處理CK真菌Chao1指數、Shannon指數降低，處理CN、CS真菌Chao1指數、Shannon指數顯著增加。與處理CK相比，處理CN、CS細菌Chao1指數和Shannon指數無顯著變化，真菌Chao1指數和Shannon指數顯著提高(表2)。

表2 不同處理植煙土壤微生物Alpha多樣性分析

2.3.2 微生物群落Beta多樣性分析 基于ASV分類學水平的PCoA分析，采用bray-curtis距離算法，細菌(圖2-a)群落和真菌(圖2-b)群落的PCoA第一坐標貢獻度分別為22.80%、38.46%。處理CK、CN、CS土壤細菌和真菌群落距離處理PB、PA均較遠，即細菌和真菌物種組成有一定的差異性。處理CN、CS細菌、真菌群落與處理CK相似，表明深耕配施有機肥和生物有機肥細菌、真菌群落組成基本相似。真菌群落R值>細菌群落，表明不同施肥處理對真菌群落結構組成差異性的影響更為顯著。

圖2 不同處理植煙土壤中細菌(a)/真菌(b)ASV組成的主成分分析

2.3.3 微生物物種Venn圖分析 不同樣本中16S rRNA(圖3-a)和ITS(圖3-b)的ASV分析結果顯示，與處理PB相比，處理PA細菌獨有ASV數目增加，真菌ASV數目減少；處理CK細菌和真菌ASV數目均減少；處理CN細菌ASV數目減少，真菌ASV數目增加；處理CS細菌和真菌ASV數目均增加。與處理CK相比，處理CN、CS細菌和真菌獨有ASV數目均增加。

圖3 基于ASV分類水平植煙土壤中細菌(a)/真菌(b)Veen分析

2.3.4 微生物群落結構分析 由圖4-a可以看出，所有樣本在門水平上的細菌優勢菌門為放線菌門Actinobacteria(29.94%～37.33%)、變形菌門Proteobacteria(14.07%～28.13%)、綠彎菌門Chloroflexi(14.20%～21.92%)、酸桿菌門Acidobacteria(9.44%～16.23%)，占總豐度和的83.26%～86.78%。其中，與處理CK相比，處理CN Acidobacteri和Actinobacteria豐度無顯著變化，Proteobacteria豐度顯著增加，Chloroflexi豐度顯著降低；處理CS Acidobacteria豐度顯著增加，Chloroflexi、Actinobacteria豐度顯著降低，Proteobacteria豐度無顯著變化。由圖4-b可知，所有樣本在門水平上的真菌優勢菌門為子囊菌門Ascomycota(58.05%～78.81%)、擔子菌門Basidiomycota(3.51%～19.08%)、被孢霉門Mortierellomycota(0.97%～13.44%)，占總豐度84.79%～93.60%。與處理CK相比，處理CN Basidiomycota豐度降低，Mortierellomycota豐度顯著增加；處理CS Ascomycota豐度增加，Basidiomycota和Mortierellomycota豐度顯著降低。

圖4 基于門分類水平植煙土壤細菌(a)和真菌(b)群落組成

2.3.5 屬水平上LEfSe物種差異分析 基于LEfSe分析，查找各處理在細菌屬分類學水平上具有顯著性差異的土壤微生物物種，結果見圖5-a。處理PB、CN、CS分別有4、9、11個屬的細菌種群存在顯著性差異，處理PA和CK屬的細菌種群則不存在差異顯著性。真菌LEfSe分析見圖5-b，處理PB、PA、CK、CN和CS分別有23、11、10、16、10個屬的真菌種群存在顯著性差異。

圖5 基于屬分類水平植煙土壤細菌(a)和真菌(b)LEfSe分析

2.4 土壤微生物群落與環境因子之間的相關性

細菌、真菌優勢菌門與土壤理化性狀相關性分析(圖6)結果表明，Actinobacteria相對豐度與URE呈顯著負相關(P<0.01)；Proteobacteria與TP、AP、INV、URE呈極顯著正相關，與pH、TK呈極顯著負相關，與OM呈顯著正相關(P<0.05，下同)；Chloroflexi與TP呈極顯著負相關，與TK呈顯著正相關，與INV呈顯著負相關。Ascomycota與TK呈極顯著正相關，與INV、URE呈極顯著負相關，與AP、AK呈顯著負相關；Basidiomycota與TP呈顯著負相關；Mortierellomycota與pH、TK呈極顯著負相關，與AP、AK、INV、URE呈極顯著正相關，與TP呈顯著正相關。由圖7-a可知，pH、有機質、全氮、全磷、全鉀、有效磷、土壤容重、蔗糖酶和脲酶顯著影響細菌群落結構，其中土壤容重影響最為顯著。由圖7-b可知，pH、有效磷顯著影響真菌群落結構組成，其中pH影響最為顯著。

X軸和Y軸分別為環境因子和物種，通過計算獲得R值和P值。R值在圖中以不同顏色展示，P值若小于0.05則用 * 號標出，右側圖例是不同R值的顏色區間。P值若小于0.05則用 * 號標出，* 代表0.01 < P ≤ 0.05，**代表0.001 < P ≤ 0.01，***代表P ≤ 0.001

圖7 土壤環境因子與不同處理土壤細菌(a)/真菌(b)群落結構的冗余分析

2.5 BugBase表型預測

通過BugBase表型預測出個樣本中土壤細菌的9種潛在類型為：好氧(Aerobic)、厭氧(Anaerobic)、移動元件(Mobile Element Containing)、兼性厭氧(Anaerobic Facultatively)、生物膜形成(Biofilm Forming)、革蘭氏陰性(Gram Negative)、革蘭氏陽性(Gram Positive)、致病性(Pathogenic)、氧化脅迫耐受(Oxidative Stress Tolerant)。各樣本中均以好氧菌、含可移動元件菌、革蘭氏陰性菌、致病性菌和氧化脅迫耐受菌為主。與處理PB相比，處理PA、CK、CN厭氧菌、革蘭氏陰性菌和氧化脅迫耐受菌豐度降低，致病性菌豐度增加；處理CS好氧、含可移動元件、致病性和氧化脅迫耐受菌豐度顯著增加，革蘭氏陰性菌豐度降低。與處理CK相比，處理CN好氧和致病性菌豐度增加，處理CS好氧菌、含可移動元件菌和氧化脅迫耐受菌豐度增加。

圖8 BugBase表型預測

2.6 FUNGuild功能預測結果

根據FUNGuild功能預測分析(圖9-a)結果，真菌群落營養類型可分為9類，病理營養型(Pathotroph)、腐生營養型(Saprotroph)、共生營養型(Symbiotroph)、病理—腐生營養型(Pathotroph-Saprotroph)、病理—共生營養型(Pathotroph-Symbiotroph)、腐生—共生營養型(Saprotroph-Symbiotroph)、病理—腐生—共生營養型(Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph)、腐生—病理—共生營養型(Saprotroph-Pathotroph-Symbiotroph)和病原菌—腐生—共生營養型(Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph)。處理PB以腐生營養型(36.38%)和病理—腐生—共生營養型(21.77%)為主，處理PA以病理營養型(27.13%)、腐生營養型(23.10%)和病理—腐生—共生營養型(25.51%)為主，處理CK以腐生營養型(44.09%)和病理—腐生—共生營養型(30.87%)為主，處理CN、CS均以腐生營養型(63.01%、44.62%)為主。

圖9 FUNGuild功能預測

通過功能類群鑒定，檢測出81種功能群，針對其中9種功能群進行分析(圖9-b)，病理營養型主要功能群為動物病原菌(Animal Pathogen)、真菌寄生菌(Fungal Parasite)和植物病原菌(Plant Pathogen)；腐生營養型主要有木質腐生菌(Wood Saprotroph)、糞腐生菌(Dung Saprotroph)、葉子腐生菌(Leaf Saprotroph)和未定義腐生菌(Undefined Saprotroph)；共生營養型主要為叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal)和外生菌根真菌(Ectomycorrhizal)。各樣本均以植物病原菌和未定義腐生菌為主，與處理PB相比，處理PA和CK植物病原菌豐度顯著增加，未定義腐生菌豐度下降；處理CN、CS植物病原菌和未定義腐生菌呈下降趨勢。與處理CK相比，處理CN、CS植物病原豐度降低，未定義腐生菌豐度增加。

3 討 論

3.1 深耕配生物有機肥對土壤微生物群落結構的影響

深耕配施生物有機肥對土壤微生物多樣性和種群豐度影響不同。大量研究表明，長期單施化學肥料會導致土壤細菌、真菌豐富度和多樣性降低，配施有機肥或單施有機肥可提高土壤細菌、真菌的豐富度和多樣性[13-15]。本試驗中，相較于處理CK，處理CN、CS植煙土壤細菌豐度和真菌豐度顯著增加，其中細菌多樣性無顯著變化，真菌豐度顯著增加。有研究表明，土壤微生物種群間存在著一定的競爭關系，某一種群的快速生長必然會因競爭營養、空間和生態位點，對其他種群的生長產生一定的抑制作用[16]。本研究中，相較于處理PB、PA，處理CN、CS土壤細菌豐度和多樣性顯著降低，真菌種群豐度和多樣性顯著增加，說明生物有機肥的投入對土壤真菌生長繁殖起了促進作用，可能是生物有機肥增加了適宜真菌生存的空間和增強了真菌對營養元素的競爭，從而抑制了細菌的數量；也可能是適宜細菌生存的pH為中性或微堿性，適宜真菌生長的pH為弱酸性或酸性，施用生物有機肥后土壤pH降低，促進真菌數量的增加[17]。土壤真菌/細菌(F/B)數量比可反映土壤肥力和健康狀況，有研究指出F/B值較高時微生物對周圍環境響應積極，農田生態系統具有較高的可持續性[18]。張明等[19]研究發現有機肥較單施化肥處理顯著促進細菌、真菌生長和F/B，本研究結果與之相一致。

大量施肥方式的研究表明，各類土壤樣本細菌優勢菌門主要包括Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria等，且總相對豐度占細菌群落的70%以上[20-21]；與細菌群落一樣，有機無機配施土壤中真菌門子囊菌門(Ascomycota)占主導地位[22-23]，本研究也得出相似結論。土壤微生物種群組成結果表明，細菌優勢菌門為Acidobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria，真菌優勢菌門為Ascomycota、Basidiomycota、Mortierellomycota，各處理優勢菌門組成基本相似，相對豐度差異性達到顯著性水平。與處理CK相比，處理CN Proteobacteria、Mortierellomycota豐度增加，Chloroflexi、Basidiomycota豐度降低；處理CS Acidobacteria、Ascomycota相對豐度增加，Chloroflexi、Actinobacteria、Basidiomycota、Mortierellomycota豐度降低。進一步查找各處理間在屬水平上具有顯著性差異的物種，基于LEfSe分析結果表明單施化肥導致細菌和真菌差異性物種數減少，種群多樣性呈降低趨勢，而增施有機肥和生物有機肥可提高細菌和真菌差異物種數。

3.2 土壤環境因子與土壤微生物群落結構的耦合關系

土壤環境因子與土壤微生物是相互作用、相輔相成的，共同影響耕地生產力和作物生長。一方面，施肥可通過改變土壤理化性質和養分含量，間接引起微生物生長、代謝過程和群落組成發生變化，同時土壤養分作為土壤酶的代謝底物，其含量變化也影響土壤酶的活性；另一方面，土壤微生物會參與土壤有機質的分解和轉化，其活性和組成的改變也導致自身代謝、死亡和沉積等改變，進而改變土壤理化特征[24]。本研究中添加有機肥和生物有機肥后，土壤pH由弱堿性向中性轉化，原因可能是有機肥中有機物質在分解過程中產生的腐殖酸是包含有多種酸性功能團的弱酸，可增強土壤的酸堿緩沖能力，達到緩沖土壤pH的效果[25]。通過對環境因子和微生物種群間的Spearman相關性分析和冗余分析，結果表明不同的環境因子對微生物種群豐度和群落組成的影響不同，總體上來看，pH和有效磷對土壤細菌和真菌的影響較為顯著。

3.3 深耕配施生物有機肥對土壤微生物功能類群的影響

本研究通過BugBase表型預測來揭示細菌功能性狀對不同施肥模式的響應，結果發現配施生物有機肥處理好氧細菌豐度顯著增加，相反厭氧菌的豐度下降。酸桿菌門宜在厭氧和微氧、pH低的環境中生存[26]，配施生物有機肥后pH、酸桿菌豐度下降，土壤厭氧細菌豐度變化趨勢一致。研究發現配施生物有機肥后可移動元件含量、細菌的生物膜形成、兼性厭氧菌和氧化脅迫耐受菌豐度增加，原因可能是這些功能類群涉及較多部分的是變形菌門一類，變形菌門大多是兼性或專性厭氧菌，大多數外膜由脂多糖組成，同時放線菌門和變形菌門具有較高的生態位偏好[27]，而本研究中放線菌門和變形菌門配施生物有機肥后豐度呈上升趨勢。FUNGuild功能預測結果表明，配施生物有機肥后真菌群落的營養類型主要是腐生營養型，群落功能主要是植物病原菌和未定義腐生菌。其中，營養類型中腐生營養型和病理營養型豐度呈上升趨勢，糞腐生菌和未定義腐生菌豐度增加，說明向植煙土壤中添加生物有機肥增強了土壤真菌的分解能力；群落功能中植物病原菌豐度降低，說明向植煙土壤中添加生物有機肥降低了煙草的發病風險，從而減少經濟損失。

4 結 論

深耕配施生物有機肥顯著提高土壤有機質、全磷和速效磷含量以及蔗糖酶和脲酶活性，顯著降低土壤pH；顯著提高真菌Chao1指數和Shannon指數，并顯著促進細菌和真菌群落差異性增強，而且對其群落結構組成差異性的影響更為顯著；顯著提高了放線菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和子囊菌門(Ascomycota)的種群豐度，降低了綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Actinobacteria)、擔子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)的種群豐度，導致屬水平的細菌和真菌顯著差異性物種增加。深耕配施生物有機肥顯著影響土壤微生物功能類群，其中致病性細菌和植物病原真菌豐度顯著下降。影響土壤細菌和真菌群落結構的主要理化因子分別是土壤容重和pH。總之，深耕配施生物有機肥可通過降低土壤容重和pH，增加植煙土壤養分含量，提高土壤生物活性，促進土壤微生物功能多樣性形成，是堿性植煙土壤質量提升的有效措施。