基于高通量測序的魔芋根際土壤真菌多樣性分析

王佰濤, 楊文玲, 雷 高, 李珊珊, 劉德海

(河南省科學(xué)院生物研究所有限責任公司, 鄭州 450008)

【研究意義】魔芋(Amorphophalluskonjac, K.Koch)，別名蛇玉米、鬼芋，屬南天星科魔芋屬，產(chǎn)地主要在中國、日本等東南亞國家[1]。作為世界衛(wèi)生組織公布的“十大保健食品”之一，魔芋本身營養(yǎng)豐富，其作為一些地區(qū)的重要食物來源種植歷史悠久，當前在食品、醫(yī)療、畜牧等領(lǐng)域應(yīng)用較多[2-4]。魔芋種植過程中對生長環(huán)境要求較高，不僅需要合適的海拔和濕度，魔芋根際微生物平衡對魔芋的生長也非常重要，當魔芋根際微生物失衡時更易導(dǎo)致病害的發(fā)生[5-6]，目前對魔芋根際土壤細菌多樣性研究較多，而對真菌群落多樣性研究較少。因此，了解魔芋根際真菌群落多樣性不僅有利于了解魔芋的生長情況和病害情況，還能促進魔芋行業(yè)的發(fā)展[7]。【前人研究進展】魔芋的主要成分是葡甘露聚糖(Konjac Glucomannan, KGM)[8]，葡甘露聚糖主要是降解成為葡甘露低聚糖進行應(yīng)用[9]。目前存在一些物理化學(xué)方法[10]，但生物方法利用微生物發(fā)酵降解，具有綠色、高效等優(yōu)勢好[11-14]，分析根際土壤真菌群落多樣性有助于尋找相關(guān)微生物，而目前關(guān)于魔芋根際土壤細菌多樣性分析的研究內(nèi)容較多[15]，對魔芋根際土壤真菌群落研究內(nèi)容較少。【本研究切入點】魔芋根際真菌群落的生態(tài)功能對于魔芋生長非常重要，其不僅能夠促進魔芋生長，還具備降解農(nóng)藥及重金屬污染、防治病害等功能[16-17]。微生物測序技術(shù)優(yōu)勢明顯，其快速、高效、精確的特點在微生物多樣性分析中應(yīng)用廣泛[18]。如圖1所示，本研究通過從不同地區(qū)采集魔芋根際土壤樣品，利用Illumina MiSeq高通量測序?qū)δв蟾H土壤真菌群落進行了多樣性分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】對不同地區(qū)的根際土壤真菌多樣性進行了對比，詳細分析了不同地區(qū)真菌群落在門、綱、屬不同水平的優(yōu)勢菌屬和豐度高低，以期為魔芋的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供幫助，為實現(xiàn)高效制備葡甘露低聚糖奠定基礎(chǔ)。

圖1 魔芋根際土壤真菌群落多樣性分析流程

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗樣品地點為3處(表1)。在每個取樣地分別隨機選擇3株魔芋進行取樣，取樣時，除去表層土壤，在0～20 cm深度范圍內(nèi)采集魔芋根際土壤。將采集的魔芋根際土壤樣品快速保存至低溫保藏箱中，無菌條件研磨后用于實驗。

表1 采樣信息統(tǒng)計

1.2 實驗設(shè)計

試驗設(shè)置3組樣品，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，分別是昆明樣品(A)：A1、A2、A3；南平樣品(B)：B1、B2、B3；南陽樣品(C)：C1、C2、C3。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 基因組提取和PCR擴增 根據(jù) DNA提取試劑盒說明書進行微生物群落總 DNA 提取，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測定DNA 濃度和純度；使用ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)對核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid, rRNA)基因ITS區(qū)進行 PCR 擴增。

1.3.2 Illumina Miseq 測序 將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒進行回收產(chǎn)物純化，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用微型熒光計對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用DNA建庫試劑盒進行建庫: ①接頭鏈接；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR擴`增進行文庫模板的富集；④磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI 序列讀取(Sequence read archive，SRA)數(shù)據(jù)庫。

1.4 數(shù)據(jù)優(yōu)化與聚類分析

使用Trimmomatic軟件原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接：使用UPARSE軟件操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)聚類，根據(jù) 97%的相似度對序列進行OTU聚類，使用UCHIME 軟件剔除嵌合體，利用RDP classifier 軟件對每條序列進行物種分類注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 三地區(qū)真菌序列統(tǒng)計和多樣性分析

利用Illumina Miseq 測序之后分別獲得有效序列數(shù)為A1：73 192、A2：69 003、A3：71 663、B1：72 179、B2：68 728、B3：70 393、C1：71 077、C2：73 958、C3：67 715。對樣品序列數(shù)進行抽平處理，抽平后序列數(shù)為67 715。在序列相似性97%水平進行序列劃分OTU，9個樣品共得到3770個OTUs。對3組樣品進行Alpha多樣性分析，Shannon指數(shù)值越高，Simpson指數(shù)值越低，說明群落多樣性越高，Chao1指數(shù)或ACE指數(shù)越大，說明群落豐富度越高[19]。如表2所示，不同地區(qū)真菌群落多樣性不同，比較3組樣品的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)，C樣品的香農(nóng)指數(shù)較高，辛普森指數(shù)較低，說明C樣品的真菌群落多樣性較高。C樣品的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)對比A樣品和B樣品均較高，說明C樣品真菌群落豐富度較高。總的來說，無論是豐富度還是多樣性，C樣品均較高。覆蓋率越接近于1，說明測序深度越合理，測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中的所有物種。由表可知A樣品、B樣品、C樣品覆蓋率均>99%，表明取樣合理，測序結(jié)果能夠真實反映昆明、南平、南陽3地的真菌群落。如圖2所示，對3組數(shù)據(jù)OTU水平進行顯著性差異分析，結(jié)果顯示C樣品的香農(nóng)指數(shù)與A、B 樣品存在顯著性差異。通過3組樣品對比分析發(fā)現(xiàn)，南陽樣品為半年生魔芋植株，其在3組樣品中真菌群落多樣性最高，推測在魔芋種植半年以后逐漸建立微生態(tài)平衡，真菌群落多樣性達到最大，南平樣品為3年生魔芋植株，真菌群落多樣性下降，說明隨著年限的增長優(yōu)勢菌屬的相對豐度逐漸增長，導(dǎo)致整體真菌群落多樣性有所降低，而海拔高度和經(jīng)緯度對魔芋根際土壤真菌群落多樣性影響較小。

*代表顯著相關(guān)(P<0.05)

表2 不同地區(qū)樣品真菌群落多樣性分析

稀釋曲線能夠反映采集樣品測序結(jié)果的覆蓋度和真菌群落的測序深度[20]，如圖3所示，3組樣品序列數(shù)達到4000 OTU水平時變化較大，隨后隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線趨于平穩(wěn)，曲線變化趨勢近似一條直線，更多的取樣只會產(chǎn)生少量新的OTU，說明本次3組樣品取樣測序數(shù)據(jù)合理。

圖3 基于香農(nóng)指數(shù)不同地區(qū)樣品的稀釋曲線

2.2 真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.2.1 昆明地區(qū)樣品真菌菌落結(jié)構(gòu)組成 A組樣品真菌屬于16個真菌門，55個綱，117個目，246個科，489個屬。在門水平，有4個真菌門的豐度≥1%，是A組樣品的優(yōu)勢菌群，其中子囊菌門(Ascomycota)的豐度為55.24%，擔子菌門(Basidiomycota)的豐度為21.49%，被孢霉菌門(Mortierellomycota)的豐度為20.18%，其余12個門均低于1%，共占1.25%(圖4)。

圖4 A樣品門水平真菌群落組成

如表3所示，在綱水平屬于55個綱，相對豐度≥1%的綱有7個，其中子囊菌門的糞殼菌綱(Sordariomycetes，32.29%)豐度最高，被孢霉菌門的被孢霉綱(Mortierellomycetes，20.13%)次之，其他還有擔子菌門的銀耳綱(Tremellomycetes)等優(yōu)勢菌群。

表3 A樣品綱水平真菌組成及相對豐度

昆明地區(qū)樣品真菌群落在屬水平上共有489個屬，其中有13個真菌屬的豐度≥1%，屬于優(yōu)勢菌屬，主要包含被孢霉屬(Mortierella)20.13%、赤霉屬(Gibberella)6.07%、截盤多孢霉屬(Truncatella)3.91%、鐮刀霉屬(Fusarium)3.25%、青霉屬(Penicillium)2.57%和硬皮地星屬(Astraeus)2.22%等(圖5)。

圖5 A樣品屬水平真菌群落組成

2.2.2 南平地區(qū)樣品真菌菌落結(jié)構(gòu)組成 B組樣品真菌屬于12個真菌門，38個綱，88個目，189個科，361個屬。在門水平，有4個真菌門的豐度≥1%，是B組樣品的優(yōu)勢菌群，其中子囊菌門(Ascomycota)的豐度為81.71%，擔子菌門(Basidiomycota)的豐度為13.00%，被孢霉菌門(Mortierellomycota)的豐度為2.83%，未分類門為1.24%，其余8個門均低于1%，共占1.22%(圖6)。

圖6 B樣品門水平真菌群落組成

如表4所示，在綱水平屬于38個綱，相對豐度≥1%的綱有8個，其中子囊菌門的糞殼菌綱(Sordariomycetes,66.15%)豐度最高，擔子菌門的傘菌綱(Agaricomycetes,8.05%)次之，其他還有子囊菌門的座囊菌綱(Dothideomycetes)等優(yōu)勢菌群。

表4 B樣品綱水平真菌組成及相對豐度

南平地區(qū)樣品真菌群落在屬水平上共有361個屬，有22個真菌屬的豐度≥1%，屬于優(yōu)勢菌屬，主要包含赤霉屬(Gibberella，17.77%)、亡革菌屬(Thanatephorus，7.79%)、隱囊菌屬(Aphanoascus，4.22%)、節(jié)擔菌屬(Wallemia，3.96%)、枝孢霉屬(Cladosporium，3.50%)、鐮刀霉屬(Fusarium，2.90%)、綠僵菌屬(Metarhizium，2.87%)、被孢霉屬(Mortierella，2.72%)等(圖7)。

圖7 B樣品屬水平真菌群落組成

2.2.3 南陽地區(qū)樣品真菌菌落結(jié)構(gòu)組成 C組樣品真菌屬于16個真菌門，48個綱，109個目，256個科，540個屬。在門水平，有5個真菌門的豐度≥1%，是C組樣品的優(yōu)勢菌群，其中子囊菌門(Ascomycota)的豐度為67.72%，擔子菌門(Basidiomycota)的豐度為13.36%，被孢霉菌門(Mortierellomycota)的豐度為5.27%，羅茲菌門(Rozellomycota)的豐度為6.88%，未分類門為5.61%，其余11個門均低于1%，共占1.16%(圖8)。

圖8 C樣品門水平真菌群落組成

如表5所示，在綱水平屬于48個綱，相對豐度≥1%的綱有11個，其中子囊菌門的糞殼菌綱(Sordariomycetes，41.20%)豐度最高，子囊菌門的座囊菌綱(Dothideomycetes，13.35%)次之，其他還有擔子菌門的銀耳綱(Tremellomycetes)等優(yōu)勢菌群。

表5 C樣品綱水平真菌組成及相對豐度

如圖9所示，南陽地區(qū)樣品真菌群落的豐富度和均勻度均較高，在屬水平上共有540個屬，有25個真菌屬的豐度≥1%，屬于優(yōu)勢菌屬，主要包含Paraboeremia屬(6.46%)、被孢霉屬(Mortierella，5.26%、)新赤殼屬(Neocosmospora，3.68%)、木霉屬(Trichoderma，3.60%)、Solicoccozyma屬(3.40%)、青霉屬(Penicillium，2.99%)、鐮刀霉屬(Fusarium，2.60%)、Tausonia屬(2.49%)、膝梗孢屬(Gonytrichum，2.39%)、支孢霉屬(Aremonium，2.21%)、綠僵菌屬(Metarhizium，1.18%)等。其中木霉屬真菌在我國工業(yè)、農(nóng)業(yè)及環(huán)境修復(fù)方面都占據(jù)舉足輕重的地位[21]，木霉屬真菌的生物降解轉(zhuǎn)化及產(chǎn)纖維素酶在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上應(yīng)用較多[22]，并且通過研究發(fā)現(xiàn)利用木霉屬真菌進行重金屬污染修復(fù)方面也能表現(xiàn)不錯的效果[23]。昆明樣品中的優(yōu)勢菌屬主要是被孢霉屬(Mortierella)、截盤多孢霉屬(Truncatella)、青霉屬(Penicillium)和硬皮地星屬(Astraeus,2.22%)等。其中，青霉屬真菌為較常見且應(yīng)用范圍較廣的真菌屬，其在生物轉(zhuǎn)化、醫(yī)學(xué)及環(huán)保等方面應(yīng)用較多[24]，在自然界青霉菌屬能夠參與多種天然產(chǎn)物降解，也能產(chǎn)生多種蛋白酶、木質(zhì)素酶等多種生物酶[25]，還能在多環(huán)芳烴污染物處理方面發(fā)揮重要作用[26]。此外，青霉菌屬的許多次級代謝產(chǎn)物在抗生素領(lǐng)域應(yīng)用歷史悠久[27]，近年來其在癌癥治療方面的應(yīng)用也有了新的突破[28]。

圖9 C樣品屬水平真菌群落組成

2.3 組間差異比較分析

由樣品菌落構(gòu)成分析和物種Venn圖(圖10)可知，3組采集樣品真菌群落多樣性較高，真菌群落結(jié)構(gòu)差異性適中，存在共有和特有物種。3組樣品真菌物種廣泛存在擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉菌門(Mortierellomycota)3個門類。A樣品OTU數(shù)量為1704個，B樣品OTU數(shù)量為1204個，C樣品OTU數(shù)量為2118個。A組樣品與B組樣品共有384個OTUs，A組樣品與C組樣品共有640個OTUs，B組樣品與C組樣品共有515個OTUs，3組樣品共有283個OTUs。A組樣品和B組樣品共有優(yōu)勢真菌屬：赤霉屬(Gibberella)、鐮刀霉屬(Fusarium)、被孢霉屬(Mortierella)、毛殼菌屬(Chaetomium)。B組樣品和C組樣品共有優(yōu)勢真菌屬：鐮刀霉屬(Fusarium)、支頂孢屬(Acremonium)、新赤殼屬(Neocosmospora)、被孢霉屬(Mortierella)、Ramophialophora屬、Chordomyces屬。A組樣品和C組樣品共有優(yōu)勢真菌屬：被孢霉屬(Mortierella)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、鐮刀霉屬(Fusarium)、Solicoccozyma屬、Saitozyma屬。三者共有優(yōu)勢真菌屬為被孢霉屬(Mortierella)和鐮刀霉屬(Fusarium)。

圖10 不同地區(qū)樣品Venn分析

基于3組樣品中群落豐度數(shù)據(jù)，運用嚴格的統(tǒng)計學(xué)方法檢測不同樣品真菌群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種，進行假設(shè)性檢驗，評估觀察到的差異的顯著性。對比3組樣品真菌群落豐度水平，結(jié)果顯示被孢霉屬、赤霉屬、Saitozyma屬、Solicoccozyma屬、Paraboeremia屬、青霉屬、木霉屬等菌屬在3組樣品中群落豐度差異較大，其中赤霉屬、木霉屬真菌群落豐度在3組樣品中存在顯著性差異(P<0.05，圖11)。

*表示差異顯著，**表示差異極顯著

2.4 真菌群落功能預(yù)測分析

如表6所示，通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析，真菌參與了多種代謝功能，其中包含β-甘露聚糖酶、α-葡聚糖合酶、α-甘露聚糖酶等功能，為以后篩選或指導(dǎo)微生物利用提供幫助。

表6 不同地區(qū)樣品真菌群落KEGG功能豐度統(tǒng)計

3 討 論

通過利用高通量測序技術(shù)對三地區(qū)樣品真菌群落多樣性進行了分析，共得到3770個OTUs，獲得真菌菌落17門、62綱、141目、326科、747屬、1302種。C樣品的香農(nóng)指數(shù)較高，辛普森指數(shù)較低，Chao1 指數(shù)和ACE指數(shù)高，表明C樣品真菌群落多樣性和豐富度較高。物種組成分析結(jié)果表明不同地區(qū)魔芋根際土壤真菌群落存在差異，赤霉屬、木霉屬真菌群落豐度在3組樣品中存在顯著差異(P<0.05)。3組采集樣品真菌群落多樣性較高，A組樣品與B組樣品共有384個OTUs，A組樣品與C組樣品共有640個OTUs，B組樣品與C組樣品共有515個OTUs，3組樣品共有283個OTUs。C樣品真菌參與了多種代謝功能，其中包含β-甘露聚糖酶、α-葡聚糖合酶、α-甘露聚糖酶等功能，為以后篩選或者定向指導(dǎo)微生物利用提供幫助。3組樣品對比分析發(fā)現(xiàn)，種植年限對魔芋種魔芋根際土壤真菌群落多樣性影響較大，而海拔高度和經(jīng)緯度對其影響較小。

4 結(jié) 論

通過利用高通量測序技術(shù)對三地區(qū)真菌群落多樣性進行了分析，對比分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)魔芋根際土壤真菌群落差異較大，種植年限對魔芋根際土壤真菌群落多樣性水平影響較大，而海拔高度和經(jīng)緯度對魔芋根際土壤真菌群落多樣性水平影響較小，為魔芋的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了幫助。