北蒼術根腐病植株根際土壤真菌群落多樣性分析

高鑫媛，趙紅玲，白茹玥，李 哲，魏金月，趙藍青青，趙春穎

(承德醫學院/河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北 承德 067000)

【研究意義】蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北蒼術Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖[1]，是常用的中藥材，其主要活性成分為蒼術素、β-桉葉油醇、蒼術酮等[2]，臨床上具有抗腫瘤[3]、調節腸胃[4]、抑制膽固醇合成[5]和免疫調節[6]等作用，并在治療新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 19，COVID-19)中起到重要作用[7]。近年來，野生北蒼術逐漸減少，栽培北蒼術藥材在市場上的占有率不斷升高，北蒼術的野生變家種已成為必然趨勢，但在栽培的過程中遇到許多的土傳病害問題，其中根腐病較為嚴重。北蒼術植株根腐病初期的表現為葉片變黃、枯萎，隨之根莖開始腐爛，呈黑褐色，并散發的異味。有研究表明，根腐病是中藥材生長過程中最為常見的土傳病害，其具有極大危害性[8]。導致中藥材根腐病的原因較為復雜，包括土壤酸堿度、溫度、濕度及植物連作等[9-10]。植物連作可導致植物根際土壤中的微生物群落結構發生變化，而微生物群落又是土壤的重要組成部分，在代謝循環、生長發育、抗病性、非生物脅迫耐受性及合成促生激素等方面發揮著不可或缺的作用[11-12]。真菌被認為是植物患根腐病的主要原因之一[13]，人參的根腐病致病菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(F.solani)[14]；三七的根腐病致病菌為茄腐鐮刀菌(F.solani)、尖孢鐮刀菌等[15-16]。因此，研究北蒼術患根腐病植株與健康植株根際土壤真菌的多樣性，探索兩者之間的真菌群落結構的變化，可以給解決北蒼術植株的根腐病問題提供理論依據。【前人研究進展】郭蘭萍等[17]提取了一至二年生栽培茅蒼術根際土壤微生物的DNA，運用ARDRA(amplified rDNA restriction analysis)技術對真菌進行了鑒定與比較，發現二年生茅蒼術根際土壤中真菌相比一年生降低49.25%，所以判斷生長多年的茅蒼術發生病蟲害多，可能與根際土壤微生物的數量及群落的變化有關。【本研究切入點】有關北蒼術植株患根腐病的根際土壤微生物的多樣性尚未研究，差異菌群的功能多樣性與北蒼術植株根腐病根際土壤理化性質及土壤酶活的互作關系尚待驗證。【擬解決的關鍵問題】利用高通量測序技術(High-throughput sequencing)[18-20]分析北蒼術根腐病與健康植株根際土壤微生物群落組成與變化特征，并對土壤理化性質與酶活性進行了定量分析，旨在了解北蒼術根腐病發病機理和為防治北蒼術根腐病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 根際土壤樣品采集

土壤樣品2020年10月采集于河北省承德市隆化縣韓家店村(北蒼術種植基地科研實驗基地，海拔：858.18 m；117°24′43″E，41°34′57″N)。隨機選取二年生北蒼術根腐病植株根際土壤及健康植株根際土壤分別記錄為CB和CJ。所選取的植株經承德醫學院趙春穎教授鑒定為北蒼術。每個處理3次重復。取附著于根系的土壤作為根際土壤，裝入自封袋，低溫運輸至實驗室，將采集的土壤過80目篩，去除土壤根系枯葉等雜質，分為2份，1份用于提取土壤微生物DNA，在-80 ℃條件下貯藏，1份用于檢測土壤酶活和理化性質。

1.2 土壤理化性質及酶活的測定

使用土壤速測儀進行土壤速效N、速效P、速效K及土壤pH的測定(PR-3001-TRREC-N01 壤博士土壤檢測儀)。使用土壤堿性磷酸酶(S-AKP)試劑盒(BC0280 Solarbio)，土壤脲酶(S-UE)試劑盒(BC0152 Solarbio)，土壤蔗糖酶(S-SC)試劑盒(BC0240 Solarbio)按照說明進行土壤酶活的測定，酶標儀(S/N 601-0725 BMG LABTECH 德國)。

1.3 土壤微生物DNA提取

使用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)提取土壤樣品微生物總DNA，DNA提取液在1%瓊脂糖凝膠上檢測提取質量，DNA濃度和純度用NanoDrop 2000紫外可見分光光度計(Thermo Scientific，Wilmington，USA)測定。

1.4 土壤真菌 ITS 序列的 PCR 擴增及高通量測序

采用真菌通用引物[ITS1FCTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA/ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)]擴增。通過ABI GeneAmp?9700 PCR熱循環儀(ABI，CA，USA)擴增真菌ITS區域。PCR產物使用AxyPrepDNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進行純化并使用定量TM熒光計(Promega，USA)進行定量。

1.5 文庫制備與上機測序

采用Illumina 公司制備測序文庫，構建的測序文庫經檢測合格后，使用Illumina Miseq平臺測序(委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成)。

1.6 數據處理與分析

測序數據用fastp 0.20.0[21]對原始Reads進行質控過濾，用FLASH 1.2.7[22]進行合并，使用Uparse(version 7.1.)對97%相似水平下的操作分類單元(OTU)進行生物信息統計分析。用RDP分類器2.2版[23]基于Unite(Release 8.0 http://unite.ut.ee/index.php)真菌數據庫及0.7的置信度閾值對每個OTU代表序列的分類進行分析，并分別在各個分類學平：門(Phylum)，綱(Class)，目(Order)，科(Family)，屬(Genus)，種(Species)統計各樣本的群落物種組成。選擇97%相似度的OTU或其他分類學水平，利用mothur(version v.1.30.2 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)進行稀釋性曲線(Rarefaction curve)分析，R語言工具制作曲線圖。基于Chao1、Sobs、Shannon、Coverage指數估計群落Alpha多樣性，并運用統計學T檢驗進行組間差異檢驗。基于主坐標分析PCoA(Principal co-ordinates analysis)及物種組成heatmap圖和樣本聚類樹來闡明不同樣本組成的差異性。使用SPSS 26.0及Origin 2021進行數據相關性分析。

2 結果與分析

2.1 蒼術根際土壤中真菌多樣性分析

2.1.1 Alpha多樣性分析 在質控后共得到463 991條ITS2序列，序列平均長度為240 bp。抽平分析后，每個樣本包括70 223條序列，共產生2538個OTUs。其中444個OTUs為根腐病北蒼術植株根際土壤樣品所有，574個OTUs為健康北蒼術植株根際土壤樣品所有，760個OTUs為樣品共有(圖1)。

圖1 不同北蒼術植株根際土壤的真菌群落的OTUs

以抽取的數據量為橫坐標，以Alpha多樣性指數值為縱坐標繪制稀釋性曲線(圖2)。曲線逐漸趨于平緩，說明獲取的Reads可以代表真菌群落的多樣性。通過計算豐富度指數(Chao1、Sobs)、辛普森指數(Simpson)、香農指數(Shannon)、覆蓋率(Coverage)等估計群落Alpha多樣性(表1)。根腐病北蒼術植株根際土壤的Shannon、Chao1及Sob指數值低于健康土壤，Simpson 指數高于健康土壤，說明根腐病北蒼術植株根際土壤中真菌群落豐度低、多樣性小。并且利用統計學T檢驗方法，檢測不同處理中真菌群落的差異性，結果顯示2個處理之間Chao1與Sobs指數無顯著差異，其余P值均≤0.05，說明這根腐病北蒼術植株根際土壤于健康植株根際土壤之間真菌群落的多樣性具有顯著性差異。

圖2 北蒼術土壤樣本的真菌群落基于OTU水平的稀釋性曲線

表1 北蒼術植株根際土壤真菌群落的Alpha多樣性指數統計

2.1.2 Beta多樣性分析 為能更直觀地反映不同處理間的差異程度，對樣本數據進行PCoA主成分分析，基于 Bray-Cruits 相異度距離反應不同處理差異性。如圖3所示，樣品點的排布代表了樣品之間的相異程度。CB主要分布在PC1及PC2軸的負端，CJ主要分布在PC1軸的正端及PC2軸的負端，兩者可明顯區分。

圖3 不同北蒼術根際土壤的真菌群落基于OTU水平的PCoA分析

對不同土壤樣本真菌群落屬水平物種組成Heatmap圖和樣本聚類樹進行分析，不同樣本中TOP 50真菌群落屬類存在差異(圖4)，其中Heatmap圖中色塊顏色代表某一個屬相對豐度的大小，且將6個樣品聚為2支，CB與CJ樣品明顯分開，表明CB與CJ樣品優勢屬組成存在差異。

圖4 不同北蒼術根際土壤真菌群落屬水平物種組成和樣本聚類樹

2.1.3 LEfSe多級物種差異辨別分析 利用LEfSe差異分析，篩選出不同處理的北蒼術植株根際土壤中具有顯著差異的微生物(LDA閾值為4)。由圖5可知，與CJ相比，CB樣本中子囊菌門(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、Netriaceae、赤霉屬(Gibberella)等顯著聚集。然而在CJ樣本中散囊菌綱(Eurotiomycetes)、暗殼腔菌科(Phaeosphaeriaceae)、Setophoma、Chaetothyriales、糞殼菌科(Sordariales)等菌群富集。

圖5 不同北蒼術根際土壤真菌群落多級物種差異辨別分析

2.2 蒼術根際土壤中真菌組成分析

2.2.1 門水平群落結構分析 在北蒼術植株根際土壤樣品中共檢測到真菌10門42綱93目208科412屬669種。如圖6所示，子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉亞門(Mortierellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)為優勢菌門。患有根腐病的北蒼術植株根際土壤及健康北蒼術植株根際土壤中子囊菌門的豐度最高，分別為75.81 %、69.94%。其次為孢霉亞門，在根腐病北蒼術植株的根際土壤中占比為14.22%，健康植株根際土壤中占17.48%。擔子菌門、壺菌門在根腐病北蒼術植株根際土壤中分別占6.44%、1.10%，在健康北蒼術植株根際土壤中分別占6.88%、1.83%。

圖6 不同北蒼術根際土壤真菌門水平真菌群落結構

2.2.2 綱水平結構群落分析 如圖7所示，糞殼菌綱(Sordariomycetes)的相對豐度排在根腐病北蒼術植株根際土壤及健康植株根際土壤的首位，其相對豐度的占比分別為45.21%、38.00%，差異較明顯。座囊菌綱(Dothideomycetes)的相對豐度在根腐病北蒼術植株根際中為18.56%，健康植株根際土壤中占比為16.20%。而排名第三、四、五的Mortierellomycetes、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、Tremeiomycetes在2組樣本中的相對豐度均為健康植株根際土壤中占比高于根腐病植株根際土壤。這三個菌在健康植株根際土壤中比根腐病植株根際土壤分別高3.26%、4.89%、2.24%。其余的Leotiomycetes、傘菌綱(Agaricomycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)在這兩組處理中的相對豐度沒有明顯的差別。

圖7 不同北蒼術根際土壤真菌綱水平真菌群落結構

2.2.3 目水平群落結構分析 在這2組樣本中排名前十的目水平豐富度均有差異(圖8)，肉座菌目(Hypocreales)在根腐病植株根際土壤和健康植株根際土壤中均為優勢種群，相對豐度較大。假球殼目(Pleosporales)在根腐病植株根際土壤的占比17.17%，而在健康植株根際土壤中占比15.28%，相差不大。排名第三的被孢霉目(Mortierellales)及排名第四的糞殼菌目(Sordariales)、排名第六的散囊菌目(Eurotiales)、排名第八的刺盾炱目(Chaetothyriales)、排名第九的線黑粉菌目(Filobasidiales)也均在健康植株根際土壤中占比高。排名第五的Microascales在根腐病植株根際土壤中土壤中占比高于健康植株根際土壤，在根腐病根際土壤中占比為5.77%，健康土壤中占比4.13%。排名第七的小叢殼目(Glomerellales)在根腐病土壤中占比高于健康土壤。由此可見，根腐病北蒼術植株根際土壤中真菌目水平的相對豐度較高的為：肉座菌目(Hypocreales)、假球殼目(Pleosporales)、Microascales、小叢殼目(Glomerellales)。健康土壤中真菌目水平的優勢群落為：被孢霉目(Mortierellales)、糞殼菌目(Sordariales)、散囊菌目(Eurotiales)、刺盾炱目(Chaetothyriales)、線黑粉菌目(Filobasidiales)。

圖8 不同北蒼術根際土壤真菌目水平真菌群落結構

2.2.4 科水平群落結構分析 叢赤殼科(Nectriaceae)的相對豐度在根腐病土壤中占比最高為18.48%(圖9)。被包霉科(Mortierellaceae)相對豐度在健康土壤中占比最高為17.44%。小雙腔菌科(Didymellaceae)在根腐病土壤和健康土壤中相對豐度差異較小，Plectosphaerellaceae菌在健康土壤中相對豐度較高分別為19.85%、12.81%。Chaetothyriaceae、Lasiosphaeriaceae、Piskurozymaceae在根腐病土壤中相對豐度較健康土壤中低，分別為5.62%、2.05%、1.94%。在這2個北蒼術土壤樣本中，排名前十的叢赤殼科(Nectriaceae)、Microascaceae、Plectosphaerellaceae、Trichocomaceae在科水平相對豐度群較健康土壤中豐度高。

圖9 不同北蒼術植株根際土壤真菌屬水平真菌群落結構

2.2.5 屬水平群落結構分析 如圖10所示，從屬水平分析，在根腐病北蒼術植株根際土壤中鐮刀菌屬(Fusarium)，赤霉屬(Gibberella)豐度較健康土壤高，分別為9.50%、7.57%。在北蒼術的健康土壤中被孢霉屬(Mortierella)、亞隔孢殼屬(Didymella)、毛殼屬(Cheatomium)、Solicoccozyma、Kernia、Penicillium等菌群豐度相對于根腐病植株根際土壤的群落占比高分別為17.55%、6.67%、4.93%、3.39%、3.49%、3.26%。在本次分析中發現Tausonia為蒼術健康的根際土壤菌群，在根腐病植株根際土壤中沒有發現。Monodictys、Neocosmospora、Althrnaria、Gibellulopsis等菌群在蒼術健康土壤中亦未發現。

圖10 不同北蒼術植株根際土壤真菌屬水平真菌群落結構

2.3 真菌群落與土壤理化性質及土壤酶活分析

2.3.1 不同土壤的理化性質及土壤酶活 由表2可知，CB中速效N、速效K和速效P顯著高于CJ。且相比CJ，CB的pH顯著降低，而水分含量及電導率顯著升高。在土壤的酶活檢測中，CJ處理組的酶活與CB處理組的酶活存在顯著性差異，CJ處理的S-AKP、S-UE、S-SC值顯著低與CB處理。

表2 不同樣本的土壤的化學性質

2.3.2 不同土壤的真菌群落與土壤酶活的相關性 選擇真菌群落屬水平的排名前十的菌群與土壤酶活進行相關性分析(圖11)。北蒼術植株根際土壤的pH與水分，速效N及3種土壤酶活含量呈顯著負相關，相關系數為-0.98、-0.936、-0.895、-0.954，與Kernia、Penicillium、Schizothecium、Setophoma的含量呈顯著正相關。土壤水分與土壤脲酶含量呈顯著正相關，與被孢霉屬(Mortierella)、Penicillium、Schizothecium、Setophoma含量呈顯著負相關，相關系數為-0.967、-0.954、-0.972、-0.820。毛殼屬(Cheatomium)的含量與速效P、速效K呈顯著負相關，相關系數為-0.816。Setophoma屬含量與Solicoccozyma屬、Kernia屬、Schizothecium屬呈顯著正相關，相關系數為0.945、0.887、0.890。鐮刀菌屬(Fusarium)、亞隔孢殼屬(Didymella)、赤霉屬(Gibberella)與土壤理化性質及酶活沒有顯著的相關關系。

*.在 0.05 水平(雙側)上顯著相關

3 討 論

本研究采用高通量測序技術對二年生的根腐病北蒼術植株根際土壤及健康北蒼術植株根際土壤根際真菌群落多樣性進行初步研究，共獲得其根際在不同分類級別的優勢分類群的總數及其相對豐度，包括門、綱、目、科、屬、種等。二年生根腐病北蒼術植株根際土壤的真菌群落的多樣性及豐富度都低于健康北蒼術植株根際土壤真菌落，與茅蒼術根際微生物的變化相同[15]。

研究表明，子囊菌門和擔子菌門的微生物是主要的土壤真菌分解者[26]，在本研究中，所有土壤樣本中子囊菌門和擔子菌門的相對豐度最高，鐮刀菌能刺激植株內酚酸物質的積累，導致植物死亡[27-28]，酚酸類物質能調節土壤微生物群落，促進致病菌的增值，減少有益菌[29]，也有實驗證明尖孢鐮刀菌為白術的主要致病菌[30]，本次研究發現根腐病北蒼術植株根際的土壤中豐度增多的菌群含有鐮刀菌，根腐病北蒼術植株根際土壤中的子囊菌門占9.50%，也從側面印證了該結論。吳小強等[31]運用高通量測序技術對不同生長年限的蒼術健康植株根際土壤微生物進行分析，發現隨著種植年限增長，Tausonia屬豐度降低，本研究中在健康植株土壤中發現Tausonia屬的相對豐度為1.77%，在根腐病土壤中未發現。毛殼菌是一類重要的資源真菌，作為生防菌對植物病原菌具有很好的防治效果[32]，該類真菌含量與土壤的pH呈顯著相關，在健康土壤中含量較多，在根腐病土壤中含量較少。Setophoma屬被認為是黃精根莖中的優勢內生菌屬[33]，在健康北蒼術植株的根際土壤中豐度也比根腐病植株根際土壤中豐度高。Solicoccozyma屬在重樓的健康植株根際土豐度占比較高[34]，Kernia屬是番茄的致病菌[35]，但是在健康北蒼術植株根際土壤中豐富高于根腐病植株根際土壤，說明此類菌可能不是北蒼術植株患根腐病的主要致病菌，亦或者其他的生防菌對該菌屬起著抑制作用。特殊生境中的Schizothecium菌對促進宿主植物生長，提高耐受及環境脅迫能力等方面都發揮了重要影響[36-37]，本研究發現該菌群在健康北蒼術植株根際土壤中豐度亦相對高。所以北蒼術根腐病的發生和以上菌群的增加或減少可能有著一定聯系。但是要明確這些菌群對北蒼術根際土壤中真菌是促生或抑制，后續課題組將進一步進行驗證。

土壤pH可以影響土壤的所有化學，物理和生物特性，也是影響根際土壤微生物群落組成的主要因素[38]。本研究中，根腐病北蒼術植株根際土壤的pH小于健康土壤。當pH小于6時，土壤微生物的群落多樣性會隨著pH的降低而減少[39]。本研究發現在根腐病植株根際土壤中的速效N、速效P、速效K及含水量都高于健康植株根際土壤，分析是植物根的腐爛導致植株吸收水分能力減弱，土壤含水量增加，長時間的根腐病侵染會降低植株的活力和土壤微生物生物量，改變真菌群落組成和土壤功能，使其向更快的有機碳分解方向發展，這可能會增加土壤有機質的消耗[40]。根腐病植株根際的土壤電導率高于健康植株根際土壤，表明根腐病可以導致細胞膜透性的增大，離子外滲量增加，細胞膜的完整性可能已經被破壞[40]。要反應土壤的質量，酶活亦是重要指標[24]。在生理代謝過程中，土壤酶活性增強可以加速有機物含量的增加，給與微生物生長的養分，促使微生物的繁殖速度加快[41]。結合Acostamartinez等[42]、Liu等[43]研究證明：堿性磷酸酶是影響藥用植物連作的一種關鍵的胞外酶，與微生物群落結構和組成的變化密切相關。在本次實驗中，發現土壤堿性磷酸酶活性與土壤pH呈顯著相關性。可判斷這可能亦是北蒼術患根腐病原因之一。

4 結 論

在北蒼術植株根際土壤微生物真菌群落豐度的研究中，常見生防菌毛殼屬(Cheatomium)在根腐病北蒼術植株根際土壤中占比較少，Schizothecium菌在健康北蒼術植株根際土壤中占比豐度更高。常見致病菌鐮刀菌(Fusarium)在根腐病北蒼術植株根際土壤中占比多。在北蒼術的栽培過程中，為了降低北蒼術植株患根腐病的發病率，可以結合北蒼術健康植株根際土壤的微生物真菌群落豐度及土壤理化性質與酶活的改變，對根腐病植株的根際土壤微生物的群落結構進行改善，從而減少北蒼術患根腐病的情況。但是，目前可以尋找到的指示菌是否能夠真正用于指導病害發生檢測和生防調控，還必須深入、全面地研究和驗證。