接種五種根系真菌對油松幼苗促生效應的研究

徐玲潔，鄭妍妍，馮花蕾，周 勇

(河北農業大學，河北 保定 071000)

【研究意義】油松(Pinustabulaeformis)對菌根真菌的依賴性很強，人工接種菌根真菌可促進油松生長，提高油松抗逆性[1]。此外，油松也能與多種真菌形成共生體，如楊韌等[2]在陜北不同地區油松根系真菌資源調查中分離鑒定出21種真菌，包括外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi, ECMF)、DSE、腐生真菌和病原真菌等。雖然油松菌根資源豐富，但大部分仍未應用于生產實際，具有優良促生效果的菌劑較少[3]。因此，發掘高效促生的真菌資源并探明其促生機制對油松林木種植和生態建設具有重要理論和現實意義。【前人研究進展】油松在我國干旱半干旱地區廣泛種植，是我國北方地區重要的園林綠化樹種[4]。此外，油松還能夠提供多種重要的生態系統功能，包括富集水源、提高土壤肥力和防風固沙等[5]，在生態修復和林業發展中占有重要地位[6]。然而，由于油松幼苗生長緩慢，育苗期較長，因此，如何促進油松幼苗生長從而加速成苗是當前人工植被建設亟待解決的問題。目前，通過菌根真菌(Mycorrhizal fungi)和內生真菌(Endophytic fungi)在內的植物根系真菌提高宿主生長及抗逆性已被廣泛報道[7]。菌根真菌是存在于植物根部的一類重要真菌類群，大量研究表明，菌根真菌能夠為宿主植物帶來多種有益影響，如促進植物生長和養分吸收，以及增強宿主對生物干擾和非生物脅迫的抵抗能力等，其在生態系統建立和物質循環過程中扮演著重要角色[8]。除菌根真菌外，植物根系中也能同時定殖其他類型真菌，如深色有隔內生真菌(Dark sepatete endophyte, DSE)、印度梨形孢(Piriformosporaindica)、木霉(Trichoderma)、白僵菌(Beauveriabassiana)、綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、麝香霉(Muscodor)等[9]，具有物種豐富，生態位廣等特點。其中，DSE是植物根系內生真菌的一大類群，其特征是定殖于植物根細胞內部或細胞間隙，并形成深色有隔菌絲和微菌核[10]。DSE宿主專一性不強，存在于各種菌根和非菌根植物根系中，且分布極為廣泛，尤其是在干旱、高山、極地、重金屬污染等逆境生態系統中，這使得DSE受到越來越多研究者的關注[11-12]。研究表明，DSE不僅能體外純培養，同時還能提高宿主生態適應性，促進植物生長[13-14]，如Tellenbach等[15]研究表明，云杉(Piceaasperata)苗接種DSE菌種(Phialocephalasubalpina)可以降低腐霉菌對其的危害，并且提高了云杉苗的生物量。因此，利用DSE培育菌根化苗木在生態系統植被建設中具有廣闊應用前景。【本研究切入點】自然生境的植物通常共生更為豐富的真菌資源，具有巨大的開發潛力。本文選取油松作為研究對象，從自然生境油松分離不同類型根系真菌，并人工接種至油松幼苗，測定植株地上部分、根系和根圍土壤相關指標，分析植物根系共生真菌對油松生長和生理特性以及根圍土壤養分的影響。【擬解決的關鍵問題】發掘優良的油松根系真菌資源，闡明根系真菌對油松的生理生態效應，為研發油松高效菌劑和構建優良菌樹組合體系提供依據和材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種：5株根系真菌分離自河北霧靈山自然保護區(117°17′～117°35′E，40°29′～40°38′N)油松根系。將采集的油松根系清洗后剪成1～2 cm根段，在體式顯微鏡下找出帶有根系真菌結構的根尖，經75%乙醇和3%次氯酸鈉表面滅菌，無菌水沖洗后置于PDA培養基內，25 ℃恒溫倒置培養。待培養基內長出菌絲后進行純化，經過純化后的菌株一部分進行插片培養，待菌絲生長至蓋玻片中部，用于真菌微觀形態學觀察。另一部分純化菌株用于真菌物種鑒定。將鑒定后的真菌保存于河北農業大學園林植物生態實驗室。所有菌株在PDA培養基上28 ℃條件下培養用于接種試驗。

種子處理及幼苗培育：挑選大小均勻顆粒飽滿的油松種子，于河北農業大學園林與旅游學院溫室育苗。試驗前，使用0.5%的KMnO4溶液振蕩消毒1 h，溫水浸種1 d后置于鋪有滅菌紗布的培養皿中，25 ℃催芽。培養基質由沙子與土壤(體積比1∶1)組成，經高溫高壓蒸汽滅菌(121 ℃，2 h)后備用，當胚根伸出0.1 cm時移栽到花盆中，每盆3粒，覆1 cm厚的基質，澆透水后，室溫培養，期間定期澆水，避免幼苗缺水。

1.2 試驗設計

本試驗設置油松接種牛肝菌屬(Su)、福廷瓶頭霉(Pf)、須殼孢屬(Ps)、短梗蠕孢菌(Po)和斯氏曲霉(As)和不接種對照(CK)，共6個處理，重復5次。無菌條件下，在PDA培養基中長勢良好的真菌菌落邊緣處，取直徑為6 mm的菌餅接種于滅菌基質上，每盆接種2個菌餅，保證每盆的接種量相等，幼苗栽植時使其根系盡量與菌餅充分接觸，對照處理接種2個直徑相等的且未生長真菌的培養基，同樣方法進行幼苗栽植。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長指標測定 真菌接種1個月后檢測油松根系真菌定殖率，接種處理植株真菌定殖率均超過30%(CK處理植株真菌定殖率為0%)。植物生長10個月時收獲，收獲時測量苗高和地徑。然后將幼苗地下部分用自來水沖洗，用吸水紙吸干表面水，一部分用于根系形態測定，另一部分用于苗木的生物量及營養元素含量測定。

1.3.2 菌根生長響應 菌根生長響應(MGR)計算公式為：MGR(%)=100×(M-NMmean)/NMmean，式中,M表示接種處理的植物總干重，NMmean表示未接種處理的植物平均總干重。MGR>0表示接種處理促進植物生長，MGR<0表示接種處理抑制植物生長[16]。

1.3.3 根系形態指標測定 從各處理中選取長勢一致的油松幼苗，用蒸餾水清洗根系附著的雜物后，將幼苗根系與地上部分分離并放置于樹脂玻璃托盤中，使用中晶掃描儀(MRS-9600TFU2L,全友電腦科技(吳江)有限公司)掃描根系樣品并獲取根系圖像，用WinRHIZO圖形分析系統對根系長度、表面積、體積、平均直徑等指標進行分析。

1.3.4 植物營養元素含量測定 油松地上及地下植株經105 ℃殺青20 min，80 ℃烘干至恒重，研缽磨碎過60目篩。稱取0.5 g樣品于消煮管中，加入15 mL混酸[v(硫酸)∶v(高氯酸)=10∶1]消煮至無色透明，將消煮液定容至100 mL，用于氮、磷和鉀的測定。采用凱氏定氮法測定全氮含量(N)，鉬銻抗比色法測定全磷含量(P)，火焰分光光度法測定全鉀含量(K)[17]。

1.3.5 土壤營養元素含量測定 用毛筆輕刷苗木根部，使得根周圍2 mm以內的土散落下來，該散落的土壤即為根圍土，取根圍土壤進行風干處理，之后過60目篩，土壤速效磷經碳酸氫鈉提取后采用鉬銻抗比色法測定，土壤速效鉀經醋酸提取后采用原子分光光度計進行測定。土壤銨態氮采用KCl浸提—靛酚藍比色法測定，土壤硝態氮采用酚二磺酸比色法測定[17]。

1.4 數據處理

數據利用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan多重比較(P< 0.05)對各指標在不同處理間的差異顯著性進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 共生真菌的分子鑒定

從油松根系分離出的5株共生真菌，分別標記為WL1、WL2、WL3、WL4和WL5，利用共生真菌ITS序列與GenBank數據庫中同源序列進行比對，構建系統發育樹，并通過形態特征鑒定5株真菌為一種外生菌根真菌牛肝菌屬Suillussp.(Su)、4種內生真菌福廷瓶頭霉Phialocephalafortinii(Pf)、須殼孢屬Pseudopyrenochaetasp.(Ps)、短梗蠕孢菌Pleotrichocladiumopacum(Po)和斯氏曲霉Aspergillusspelunceus(As)(圖1～2)。

A、F:牛肝菌屬；B、G:福廷瓶頭霉；C、H:須殼孢屬.；D、I:短梗蠕孢菌；E、J:斯氏曲霉；標尺= 50 μm

2.2 接種處理對油松幼苗生長的影響

方差分析結果表明，接種處理顯著影響了油松幼苗株高、地徑、地上和地下生物量，但不同種類真菌對宿主的影響存在差異(圖3)。接種Ps和Pf顯著提高了幼苗的苗高，較CK分別增加了10.96%和3.99%。而接種Po和As對幼苗苗高的影響表現為負效應。對于苗木地徑，接種真菌對幼苗生長表現為有益或無影響，其中接種Su和Ps的苗木地徑較CK顯著增加了30.00%和15.00%，且Su顯著高于Ps。

圖2 基于18S rDNA ITS序列構建的系統發育樹

CK:不接菌處理；Po:短梗蠕孢菌; Pf:福廷瓶頭霉;Ps:須殼孢屬; As:斯氏曲霉;Su:牛肝菌屬; 不同小寫字母表示處理間差異顯著(P < 0.05)，下同

多數真菌對油松的生物量積累表現為正效應，且對油松根系的促生作用更為明顯。接種Su顯著提高苗木地上和地下部分生物量，分別較CK提高了31.57%和47.37%，而其他真菌則表現為無影響或負效應(As)。除As外，接種真菌均有增加宿主地下生物量的趨勢，且接種Pf顯著提高了苗木地下生物量，較CK提高了36.84%。可能是因為根系真菌通過侵染植物根系改變根形態，增加根系吸收面積，促進植物根系吸收水分和養分，提高植物礦質元素含量，從而促進苗木的生長。

2.3 油松幼苗菌根生長響應

油松幼苗的菌根生長響應受到真菌種類的顯著影響(圖4)。接種Pf、Ps和Su處理時油松幼苗的生長響應為正值，同時接種Su時生長響應值最高且顯著高于接種Po和As處理，表明Pf、Ps和Su3種菌株對油松幼苗具有促進作用，且接種Su促進油松幼苗生長效果較好。但是，接種Po和As的條件下，油松幼苗生長響應為負值，說明這2種真菌對宿主油松幼苗生長產生了抑制效應。由此可見，油松幼苗與其根系的真菌具有明顯的相互選擇性。實際上，同一種根系真菌與植物宿主的關系，在特定環境下可以從共生轉化為寄生關系，也可以從寄生轉化為共生關系[18]，換言之在不同環境條件下ECMF、DSE或其他類型真菌的侵染可能促進植物生長發育，協助植物增加對各種脅迫的耐受性，也可能對宿主植物造成不利影響。

圖4 油松幼苗菌根生長響應

2.4 接種處理對油松幼苗根系形態結構的影響

接種Pf和Ps的幼苗總根長和根表面積顯著高于CK處理；對于幼苗的根總體積，接種Su的幼苗根體積顯著高于其他接種處理，而接種Po的幼苗根體積顯著低于CK植株；與CK相比，接菌處理對幼苗根系的平均直徑無顯著影響，不同菌種之間只有接種Su時顯著高于接種Pf處理(表1)。相似的結果在其它真菌中也有報道，研究發現接種紅汁乳菇(Lactariushatsudake)和褐環乳牛肝菌(Suillusluteus)增加了油松根系總長度、表面積和體積，尤其是接種(S.luteus)有利于根系擴大沿根圍向不同方向生長的范圍，更利于養分和水分的吸收[19]。

表1 不同接種處理對幼苗根系形態結構的影響

2.5 接種處理對油松幼苗營養元素含量影響

對油松植株N、P、K含量分析發現：接種不同根系真菌顯著影響了油松幼苗各部分器官的養分含量(圖5)。與CK相比，接種Pf和Su均顯著促進了苗木地上及地下部分N、P、K含量，Ps顯著增加了苗木地上及地下部分P含量，As顯著促進了苗木地上部分K含量；在不同菌株之間，接種Pf和Su處理的植物各部分器官的養分含量均高于其他處理，可能是由于接種與油松幼苗親和力高、促生效果好的ECMF和DSE菌株后，改變了植物根系形態，使得根系更容易吸收土壤中的養分，提高了宿主植物中礦質營養的含量。不同接菌處理間苗木地上部分N、P含量和和地下部分P含量均為：Su>Pf>Ps>CK>Po>As，不同接菌處理間苗木地下部分N、K含量均：Su>Pf>Po>CK>Ps>As，表明Su可能對油松幼苗的養分吸收最有益。

圖5 不同接種處理對油松幼苗N、P、K含量的影響

2.6 接種處理對油松土壤營養元素含量的影響

在不同處理中，接種真菌對油松幼苗的根圍土壤養分含量影響顯著。與CK相比，接種Pf和Su處理顯著提高了土壤硝態N、銨態N、速效P和速效K的含量；而接種Po和Ps處理與CK無顯著差異。不同菌株之間對土壤養分含量的影響表現出一定差異，其中接種Su油松的土壤硝態N含量顯著高于其他接菌處理，接種Pf和Su處理的土壤銨態N、土壤速效P和速效K含量顯著高于Po和As處理(表2)。

表2 不同接種處理對油松根圍土壤養分的影響

3 討 論

本研究中探究了5種植物根系真菌對油松幼苗生長和根系形態特征的影響，結果表明多數根系真菌對油松幼苗的生長有促生效應，但受到真菌種類影響。其中，接種外生菌根真菌(ECMF)菌種Su對油松的生長有顯著促進作用，表現為接種Su處理顯著提高了油松幼苗的地徑、生物量和根體積等指標。該結果與前人關于植物與ECMF共生關系的研究結果一致，如張茹琴等[20]研究發現接種ECMF灰鵝膏菌(Amanitavaginata)和血紅鉚釘菇(Gomphidiusviscidus)顯著提高了油松株高，該結果不僅適用于油松菌根化育苗，而且也有助于自然生態系統中林木的生長。此外，已有研究發現，深色有隔內生真菌(DSE)可能具有與菌根真菌相似的生態學功能[21]，如接種DSE可以提高植物幼苗的生物量、促進植物對營養物質的吸收、增強植物的抗逆性、抗病性等[22-25]。本研究也發現，接種DSE菌種Ps和Pf顯著提高了油松幼苗總根長和根表面積，且接種Pf顯著提高了植株地下部分生物量。由于根系形態構型中根系長度和表面積等是衡量植物根系分布范圍和養分吸收能力的重要指標，因此，與ECMF接種效應相似，本研究也表明接種DSE可以調整油松的根系結構，增加根系吸收面積，從而促進油松的生長，但該影響與DSE真菌種類有關。

研究表明，植物根系真菌對于林木幼苗的促生效果以及林木菌根生長響應因菌種或菌株而異[26]。本研究接種的5個植物根系真菌中，Pf、Ps和Su均能與油松幼苗形成良好的共生關系，而Po和As與油松幼苗的共生能力較弱，其菌根生長響應為負值，這可能是由于真菌給宿主帶來的有益影響不足以抵消其對宿主植物的營養消耗造成的。Chu等[27]研究也發現，ECMF和DSE對油松抗松樹萎蔫病的影響依賴于真菌種類，接種不同真菌后對油松的影響包括了正效應、中性和負效應。鄒慧等[28]研究結果表明，接種的6個ECMF菌種中，只有接種Sclerodermapolyrhizum與Sclerodermaflavidum能夠顯著提高宿主西南樺(Betulaalnoides)幼苗生長量、養分含量、光合效率，說明兩者對于西南樺幼苗的親和力及促生效果明顯優于其它菌種。因此，對于同一個樹種，菌種類型與幼苗菌根的促生效果密切相關，而在菌根應用技術中篩選合適的菌—樹組合至關重要。

N、P、K作為植物體所需的重要大量元素，對植物的生長和發育起著重要作用。本研究發現，根系真菌的存在明顯促進了植物對N、P、K的吸收和利用，表現在Pf、Ps和Su對油松幼苗地上和地下部N、P、K的含量均有不同程度的增加，特別是接種Pf和Su均顯著促進了苗木地上及地下部分N、P、K含量。與本研究結果相似，汪遠秀等[29]研究發現，接種S.luteus的馬尾松幼苗株高、根系形態和生物量及根莖葉中N、P、K含量均高于未接種苗。產生這種結果的原因可能是菌根真菌可以釋放以硝酸鹽、銨、游離氨基酸、核酸等形式被固定在腐殖質中的N，以及分解難溶性的磷灰石、磷鋁石等磷礦物，將其轉化為可被植物吸收利用的有效P，充分調動土壤中的養分，吸收轉運給宿主植物，供植物生長[30]。本研究中，油松與分離培養的真菌Pf和Su均能夠形成良好的互惠共生關系，改變油松生長特性，從而對植物養分的吸收產生一定的影響。此外，接種ECMF和DSE后不僅能夠對油松自身生長及養分吸收產生影響，還能夠改善油松幼苗根圍土壤微環境，表現為接種Pf和Su的幼苗根圍土壤養分中N、P、K含量較對照有顯著增長。接種ECMF和DSE菌株在提高根圍土壤養分含量方面有優良的表現，原因可能是2種植物根系真菌可以通過自身或利用周圍微生物及植物等分泌多種酶類和次生代謝產物來分解有機質，改善土壤結構與環境，加速物質循環和增強宿主植物對有機營養的利用，從而加速生態系統中的物質循環[31-32]。

4 結 論

接種Pf和Su顯著提高了油松幼苗地上和地下部分生物量、植株養分以及土壤養分含量，對油松具有促生效應，且對共生體所在生境產生一定影響。因此，這2種植物根系真菌在油松育種栽培中具有較好的應用潛力。考慮到自然生境中真菌的應用可能受到多種環境因素的影響，在今后的研究中將繼續探討不同環境條件下植物根系真菌的作用潛力及影響機制，為其作為生物制劑用于林業發展提供理論支持。