紅棕杜鵑根系真菌群落組成與多樣性分析

彭黎明, 蔣顯鋒

(大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 云南 大理 671003)

【研究意義】杜鵑花屬植物廣泛分布于中國(guó)各省市，具有較高的園藝觀賞價(jià)值。中國(guó)橫斷山區(qū)域是杜鵑花屬植物的現(xiàn)代分布中心和起源分化中心，全世界有約900種杜鵑花屬植物，其中橫斷山地區(qū)就擁有將近500種。中國(guó)雖然是杜鵑花屬植物的分布中心，擁有豐富的杜鵑花資源，但是對(duì)杜鵑花屬植物資源的整理、搜集和利用與西方國(guó)家相比仍然處于起步階段。目前，在中國(guó)花卉市場(chǎng)上的杜鵑花產(chǎn)品，大部分仍然是以歐洲或日本培育的品種為主。植物根系真菌能夠顯著的影響植物的養(yǎng)分利用效率，繼而影響植物的生長(zhǎng)狀態(tài)[1-2]。菌根是指土壤中某些真菌與植物根的共生體，許多植物都具有自己特有的共生菌根(如蘭科、杜鵑花科、松科等)。如叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)、外生菌根(Ectomycorrhiza，ECM)、內(nèi)外生菌根(Ectendomycorrhiza，EEM)、蘭科植物菌根(Orchid mycorrhiza，OM)、歐石南類菌根或杜鵑花類菌根(Ericoid mycorrhiza，ERM)、漿果鵑類菌根(Arbutoid mycorrhiza，ARM)和水晶蘭類菌根(Monotropoid mycorrhiza，MM)[3]。【前人研究進(jìn)展】植物根系真菌在許多杜鵑花屬植物中都曾有過(guò)報(bào)道[4]。唐燕等[5]從轎子雪山腋花杜鵑中分離出菌根真菌Cryptosporiopsisericae,Drescehlera,Periconia等。Gorzelak等[6]在加拿大落基山脈的越橘屬(Vaccinium)植物菌根中檢測(cè)出Phialocephalafortinii，Oidiodendronmaius，Neonectriaradicicola等內(nèi)生真菌。熊丹等[7]從黔中馬尾松林下的杜鵑花(Rhododendronsimsii)中通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)出子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門等6門19綱103科154屬的根系真菌。根系真菌能提高杜鵑花科植物對(duì)于養(yǎng)分的利用效率，提高植物對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)能力[8-9]。最近的研究表明杜鵑花類菌根真菌能增強(qiáng)杜鵑花科植物的耐鹽性[10]，并能使其適應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間的重度干旱脅迫環(huán)境[11]。【本研究切入點(diǎn)】紅棕杜鵑(Rhododendronrubiginosum)是杜鵑花屬杜鵑組亮鱗杜鵑亞組的多年生常綠灌木，產(chǎn)于四川西南部、云南西北部至東北部、西藏東南，常成群落中的優(yōu)勢(shì)種。根系真菌會(huì)顯著影響杜鵑花灌叢的生存狀態(tài)，同時(shí)也是杜鵑花屬植物成功引種繁育的重要影響因素[12-13]。然而，紅棕杜鵑的根系真菌的多樣性與群落組成尚缺少研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究將基于大理馬耳山的紅棕杜鵑群落,并利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)紅棕杜鵑根系真菌多樣性開(kāi)展研究，為該物種的成功引種馴化提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

馬耳山位于云南大理鶴慶縣與洱源縣交界(26°36′2633″N，100°10′1775″E)，海拔最高處3550 m。2019年8月采集馬耳山紅棕杜鵑群落30 m × 30 m樣方內(nèi)10株成年植株的須根，采集到的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，用流水沖洗干凈去除表面泥沙，用乙醇和次氯酸鈉進(jìn)行消毒后，將樣品用無(wú)菌水振蕩洗滌多次，清洗后的根系樣品置于無(wú)菌EP管中，每個(gè)樣品約2 g，并置于-80℃保存。

1.2 樣品建庫(kù)測(cè)序

樣品送北京擎科生物科技公司做進(jìn)一步建庫(kù)測(cè)序。具體流程如下：提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。高通量測(cè)序(Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái))得到原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)，其中包含測(cè)序序列(Reads)的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 OTU劃分與真菌種類鑒定 使用Usearch軟件對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)，并基于UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各分類水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成。

1.3.2 樣品內(nèi)真菌多樣性分析 采用Alpha多樣性對(duì)樣品真菌多樣性進(jìn)行描述。使用軟件Mothur(version v.1.30)，對(duì)樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。

1.3.3 真菌生態(tài)功能分析 按照營(yíng)養(yǎng)方式將真菌分為三大類：病理營(yíng)養(yǎng)型(Pathotroph)，共生營(yíng)養(yǎng)型(Symbiotroph)，腐生營(yíng)養(yǎng)型(Saprotroph)。將三大類進(jìn)一步又分為12類，成為Guilds。軟件FUNGuild(Fungi Functional Guild)是可用于解析真菌OTU的工具，基于該軟件對(duì)樣品進(jìn)行生態(tài)功能分析。

1.3.4 真菌關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析 進(jìn)行斯皮爾曼(Spearman)秩相關(guān)分析并篩選相關(guān)性大于0.1且P值小于0.05的數(shù)據(jù)構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，并基于Python繪制根系真菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棕杜鵑根系真菌的種類科屬分布

通過(guò)對(duì)10個(gè)紅棕杜鵑植株根系樣品的高通量測(cè)序，獲得了有效序列共587 644條，聚合后得到132個(gè)OTU，分屬于3門、11綱、22目、37科、42屬。通過(guò)物種分析，主要屬于子囊菌門(73.71%)、擔(dān)子菌門(17.81%)和球囊菌門(0.119%)。主要的綱有錘舌菌綱(60.52%)、傘菌綱(17.77%)、座囊菌綱(5.87%)、子囊菌綱(3.63%)、傘囊菌綱(1.52%)。主要的目有柔膜菌目(58.02%)、傘菌目(13.94%)、煤炱目(5.79%)、肉座菌目(3.44%)、糙孢孔目(1.96%)和刺盾炱目(1.49%)；主要的科有水盤菌科(27.95%)、晶杯菌科(16.18%)、口蘑科(9.96%)、粘毛囊菌科(6.56%)、叢赤殼科(3.27%)、暗色孢科(2.58%)和球蓋菇科(2.50%)；占比較高的屬有瓶頭霉屬(27.95%)、小杯傘屬(9.96%)、樹(shù)粉孢屬(6.56%)、土赤殼屬(3.27%)、粒毛盤菌屬(2.59%)、無(wú)柄盤屬(2.58%)和盔孢傘屬(2.50%)。

2.2 紅棕杜鵑根系真菌多樣性分析

Chao1和ACE指數(shù)用于衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性。相同物種豐度的情況下，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。樣方內(nèi)10各植株的Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計(jì)如表1所示，植株2號(hào)、植株7號(hào)的香濃多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)在樣品中最高，表明2個(gè)樣品具有相對(duì)較高的物種多樣性。各植株樣品的OTU數(shù)目在24～62，植株間共享OTU數(shù)目?jī)H為2個(gè)，7號(hào)植株具有最多的特有OTU(13個(gè))，3號(hào)、5號(hào)、9號(hào)、10號(hào)植株沒(méi)有特有OTU。

表1 馬耳山紅棕杜鵑根系共生真菌群落Alpha多樣性指數(shù)

2.3 紅棕杜鵑根系真菌的生態(tài)功能多樣性

根據(jù)FUNGuild分析可知，紅棕杜鵑根系真菌包括植物內(nèi)生菌，排泄物腐生菌，木質(zhì)腐生菌，蘭科根菌真菌等多種生態(tài)類型。在檢測(cè)到的結(jié)果中，糞殼菌綱和傘菌綱是主要的腐生型真菌，錘舌菌綱是主要的共生型真菌。本研究中的OTU1，OTU35，OTU73均屬于典型的植物內(nèi)生菌，OTU25和OTU69屬于蘭科菌根真菌。紅棕杜鵑根系真菌樣品中，杜鵑花類菌根真菌(ERM)在真菌群落的組成中占較少一部分，多數(shù)為各種類型的腐生菌和多種營(yíng)養(yǎng)型的真菌(表2)。

表2 馬耳山紅棕杜鵑根系真菌生態(tài)功能分析

2.4 紅棕杜鵑根系真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

圖1顯示，每個(gè)屬在平均豐度上都具有一個(gè)或多個(gè)與其存在關(guān)聯(lián)的屬。大多數(shù)屬之間呈正相關(guān)(如Dasyscyphella，Cordyceps和Entoloma)，只有少數(shù)幾個(gè)屬間呈負(fù)相關(guān)(Meliniomyces與Serendipita，Pezicula與Cephalotheca，Chactospacria與Phialocephala，Phialocephala與Solicoccozyma，Chactospacria與Cystofilobasidium)。該關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)具有39個(gè)節(jié)點(diǎn)，89個(gè)連接，具有較高的模塊度(0.531)和嵌套性(0.395)。

圓圈代表物種，圓圈大小代表物種平均豐度大小；線條代表兩物種間相關(guān)，線的粗細(xì)代表相關(guān)性的強(qiáng)弱。橙色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)

3 討 論

3.1 群落組成多樣性

根部真菌會(huì)顯著影響共生植物的養(yǎng)分利用效率，進(jìn)而決定了植物適應(yīng)外部環(huán)境的能力，并可能影響植物的多樣性、群落結(jié)構(gòu)與生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[14]。本研究通過(guò)對(duì)10個(gè)紅棕杜鵑個(gè)體的高通量測(cè)序，獲得了滇西北優(yōu)勢(shì)杜鵑物種的根系真菌序列共587 644條，聚合后得到132個(gè)OTU，分屬于3門、11綱、22目、37科、42屬。與相同區(qū)域的其他杜鵑花屬植物相比，大理馬耳山紅棕杜鵑根系的真菌群落表現(xiàn)出較為豐富的多樣性，但相比起亞熱帶地區(qū)杜鵑群落的根系真菌多樣性明顯較低。

典型的杜鵑花類菌根真菌(ERM)有瓶頭霉屬(27.95%)和樹(shù)粉孢屬(6.38%)。此外,柔膜菌目的Rhizodermea屬和無(wú)柄盤屬都曾被國(guó)內(nèi)外學(xué)者從杜鵑花科植物菌根上分離出來(lái)，且被證實(shí)為杜鵑花類根菌。有研究表明Rhizodermea屬的成員能夠與針葉樹(shù)和杜鵑花科植物形成菌根[15-16]，并有助于形成用于植物根系之間的養(yǎng)分交換的菌絲網(wǎng)絡(luò)[17-18]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于杜鵑花菌根真菌的研究中，徐勝男等[19]在貴州百里的馬纓杜鵑根菌中，黃彩微等[20]在涼山州龍肘山銹紅杜鵑與薄葉馬銀花根部中，以及在阿根廷巴塔哥尼亞的白珠樹(shù)屬(Gaultheria)的植物菌根中[21]均檢測(cè)到樹(shù)粉孢屬的真菌，可見(jiàn)樹(shù)粉孢屬是一種廣泛存在于世界各地杜鵑花科植物中的ERM真菌。劉振華等[22]在大理的灰背杜鵑根菌中分離出了Phialocephalafortinii，此外還分離出了Cryptosporiopsisericae。Cryptosporiopsis類真菌也是一種常見(jiàn)的ERM類型真菌，多次被國(guó)內(nèi)研究者從各種杜鵑花科植物根菌中分離出來(lái)。如劉亞等[23]在浙江大盤山映山紅菌根中，唐燕等[5]在云南轎子山腋花杜鵑(Rhododendronracemosum)菌根中，劉仁陽(yáng)等[24]從貴州梵凈山雷山杜鵑菌根中均分離出此類真菌。而此次在大理馬耳山紅棕杜鵑根部真菌中并未發(fā)現(xiàn)Cryptosporiopsis類真菌，推測(cè)可能是由于該類真菌具有一定的寄主專一性。

3.2 生態(tài)功能多樣性

不同生態(tài)類型的真菌采取不同的生存策略且具備不同的營(yíng)養(yǎng)型，對(duì)宿主和環(huán)境都會(huì)產(chǎn)生不同的影響[3]。本研究中的OTU1，OTU35，OTU73均屬于典型的植物內(nèi)生菌，該類真菌廣泛地寄生于各種水生及陸生植物。感染內(nèi)生菌的植株往往比未感染內(nèi)生菌的植株更具生存競(jìng)爭(zhēng)力，并表現(xiàn)出生長(zhǎng)快速，抗病害，抗動(dòng)物危害等生存優(yōu)勢(shì)[25]。最近的研究表明，根部?jī)?nèi)生真菌還會(huì)影響植物對(duì)金屬脅迫的耐受性，改善植物的生長(zhǎng)和生理[26]。OTU25和OTU69屬于蘭科菌根真菌，該類真菌除了廣泛地寄生蘭科植物外，也會(huì)選擇杜鵑花科植物作為宿主。蘭科菌根真菌有著促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)，苗的形態(tài)建成，增強(qiáng)植物生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力和抗逆性，幫助植物克服不良生境等生態(tài)功能[27-28]。另一種常見(jiàn)的真菌生態(tài)類型為腐生營(yíng)養(yǎng)型(Saprotroph)，腐生營(yíng)養(yǎng)型又可細(xì)分為排泄物腐生菌(OTU74)，葉腐生菌(OTU66)，土壤腐生菌(OTU85)，木質(zhì)腐生菌(OTU154)等。還有大量未定義腐生菌(Undefined Saprotroph)，主要屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門。研究發(fā)現(xiàn)紅棕杜鵑大量?jī)?nèi)生真菌表現(xiàn)為多種營(yíng)養(yǎng)型的組合而并非某種單一的生態(tài)類型。如OTU142的Phoma表現(xiàn)為植物內(nèi)生菌—排泄物腐生菌—地衣寄生菌—凋落物腐生菌—植物病原菌—土壤腐生菌—木質(zhì)腐生菌多種生態(tài)類型。其原因可能是由于真菌為適應(yīng)復(fù)雜多變的生存條件而選擇了與之對(duì)應(yīng)的生存策略。在馬耳山紅棕杜鵑的根部也檢測(cè)出了例如傘菌目的外生菌根真菌(ECM)。此外，動(dòng)物病原菌也在多個(gè)OTU中被檢測(cè)出來(lái)，它們與各種腐生菌和寄生菌組成了多功能的營(yíng)養(yǎng)型。

總的來(lái)看，杜鵑花類菌根真菌(ERM)在真菌群落的組成中只占很少一部分，而大多數(shù)為各種類型的腐生菌和擁有多種營(yíng)養(yǎng)型的真菌。盡管多種不同生態(tài)類型的真菌可以共存于同一植物根系中，但也有研究表明，ECM、ERM、病原菌或其他生態(tài)類型的不同真菌物種在植物根系中可能存在競(jìng)爭(zhēng)[29]。這也為文中的少數(shù)幾個(gè)屬在平均豐度上呈負(fù)相關(guān)提供了可能的解釋。植物根系的內(nèi)生真菌與其宿主間形成了一種動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系，真菌群落在植物生長(zhǎng)不同階段也表現(xiàn)出不同的功能[30]。此外，豐富的真菌生態(tài)功能多樣性也對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定起到積極的作用[31]，并提高地上植物的生產(chǎn)力[32]。

4 結(jié) 論

本研究共檢測(cè)出紅棕杜鵑根系真菌群落包括杜鵑花類菌根真菌、蘭科植物菌根真菌、腐生真菌、病原真菌、寄生真菌等多種生態(tài)類型的真菌，表明該杜鵑屬植物具有較豐富的根系真菌生態(tài)類型。由于較高的真菌豐富度同時(shí)也意味著在該杜鵑引種栽培的過(guò)程中必須要考慮根系真菌的影響。由于采樣海拔較高，因此紅棕杜鵑根系真菌多樣性明顯低于低海拔地區(qū)。本試驗(yàn)為紅棕杜鵑物種保育、生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定和引種栽培提供了一定的科學(xué)借鑒價(jià)值。