4-辛基衣康酸抑制糖酵解調(diào)控M2型巨噬細胞極化*

陳成英，藍 利，2，袁江浪，孔星星，王新航，2，劉彧冰，李 菡，陸彩玲，李習藝，唐 深，2△

（廣西醫(yī)科大學 1.基礎(chǔ)醫(yī)學院；2.廣西高校基礎(chǔ)醫(yī)學研究重點實驗室；3.公共衛(wèi)生學院，南寧 530021）

巨噬細胞（Mφ）是固有免疫的重要細胞，主要分為促炎的M1 型Mφ 和抑炎的M2 型Mφ，在不同炎癥微環(huán)境刺激下會迅速做出反應，發(fā)揮促炎或抑炎功能，調(diào)控炎癥以限制損害和保護人體[1-2]。當暴露于促進Mφ 可塑性和重編程的細胞因子環(huán)境時，M1 和M2 型Mφ 可發(fā)生可逆的功能變化，在調(diào)節(jié)炎癥發(fā)生及消退過程中發(fā)揮著重要作用[3]。

衣康酸（itaconate，ITA）是M1 型Mφ 中最豐富的代謝產(chǎn)物之一，可以通過激活核因子相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）途徑抑制炎癥[4]。4-辛基衣康酸（4-Octyl itaconate，4OI）是一種可透過細胞膜的ITA 衍生物，在活化的Mφ 中被代謝為ITA，具有抗炎作用[5]。研究報道，4OI 可降低LPS 誘導的肺部炎癥[6]。4OI 可抑制M1 型Mφ 和促炎因子的產(chǎn)生，抑制炎癥反應[5]。研究提示，4OI 發(fā)揮抗炎作用的機制可能是通過調(diào)節(jié)M1 型Mφ 的炎癥極化。目前4OI對M2的作用機制未見詳盡報道，本項目以人髓系白血病單核細胞（THP-1）誘導M2型Mφ 為研究對象，初步研究ITA 衍生物4OI 對M2型Mφ 的影響和作用機制，為ITA 衍生物治療炎癥提供新的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

THP-1 細胞（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫）。佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、TRIzol、刃天青（Sigma公司）；白介素（IL）-4（PeproTech 公 司）；4OI（MedChemExpress）；RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco 公司）；青霉素、鏈霉素、己糖激酶（Hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）檢測試劑盒（索萊寶生物科技公司）。蛋白定量和RNA提取試劑盒（TaKaRa公司）；SYBR?Green Master（Roche公司）；引物由Invitrogen 公司合成；Leica 倒置顯微系統(tǒng)、StepOne 熒光定量PCR儀、Multiskan Go全波長酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組

按細胞密度8.5×105個/孔接種于6 孔板，將Mφ分為M0 組、M2 組、M2+4OI-L 組和M2+4OI-H 組。M0組用含100 nmol/L PMA培養(yǎng)基刺激48 h，M2 組在M0 組基礎(chǔ)上用含20ng/mL IL-4 培養(yǎng)基再誘導48 h，M2+4OI-L 組和M2+4OI-H 組在M2 組基礎(chǔ)上分別用100 μmol/L和200 μmol/L4OI再干預12 h。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察和分析

倒置顯微鏡觀察并記錄各實驗組實驗過程和終點的細胞形態(tài)。攝取各實驗組實驗終點細胞圖片，5張/組以上。通過Image J軟件連續(xù)計數(shù)各組觀察視野中1 000個Mφ，并計算偽足伸出細胞和梭形細胞的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

1.2.3 實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測M2 型Mφ 極化相關(guān)標志物和堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶-1α（carnitine palmitoyltransferase 1α，CPT-1α）的mRNA表達水平

到達實驗終點后，去除培養(yǎng)基上清，無菌PBS洗1 次，每孔加入1 mL TRIzol，提取總mRNA 后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR 反應體系：cDNA 0.4 μL，SYBR green mix 10 μL，RT-qPCR 正反向引物各1 μL，無酶水7.6 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min，（95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s）×45 個循環(huán)。RTqPCR 引物：以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列/（5’～3’）

1.2.4 微量法檢測HK和PK活性

棄去培養(yǎng)基后用PBS 洗3 次，每孔加入200 μL HK 或PK 提取液，將細胞刮下并收集于1.5 mL EP管內(nèi)，在冰浴條件下超聲裂解細胞，4 ℃離心10 min，取上清液。按照試劑說明書使用全波長酶標儀檢測各實驗組吸光度值，按照說明書公式計算HK 和PK活性。

1.2.5 刃天青法檢測線粒體呼吸鏈代謝酶活性

THP-1細胞按1.8×104個/孔細胞數(shù)接種于96孔板，按照上述分組處理完成后，每組5 個復孔，每孔加入100 μL 0.02%的刃天青溶液，并設(shè)置背景對照組，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3.5 h，在激發(fā)光波長530 nm，發(fā)射光波長590 nm 處，全波長酶標儀讀取各組熒光信號強度，熒光強度線粒體呼吸鏈代謝酶活性=各組熒光信號強度-背景對照組熒光信號強度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4OI干預對M2形態(tài)的影響

THP-1 細胞經(jīng)PMA 誘導活化為M0 型，細胞呈灰色煎蛋樣或不規(guī)則型；M0 型經(jīng)IL-4 誘導極化為M2型，細胞偽足形成和梭形樣改變；各組偽足伸出細胞和梭形細胞占比分別為M0 組8.0%、M2 組78.1%、M2+4OI-L 組68.5%和M2+4OI-H 組52.3%，與M2組相比，4OI干預后的偽足伸出細胞和梭形細胞占比減少，且M2+4OI-H 組更明顯（P＜0.01），見圖1。

圖1 Mφ極化形態(tài)學變化

2.2 4OI對M2極化相關(guān)基因表達的影響

與M0 組相比，M2 組M2 極化標志物IL-10，MRC-1，CCL22，CD209，SOCS1 和PPAR-γmRNA水平均升高（均P＜0.01）；與M2組相比，M2+4OI組M2 極化標志物IL-10，MRC-1，CCL22，CD209，SOCS1和PPAR-γmRNA 水平降低，且M2+4OI-H組較M2+4OI-L組干預作用更強（均P＜0.05），結(jié)果提示4OI干預降抑制M2極化標志物表達，抑制作用隨劑量增加而增強，見圖2。據(jù)此，本文選擇200 μmol/L 4OI開展后續(xù)實驗研究。

圖2 M2極化相關(guān)基因mRNA表達水平比較

2.3 4OI干預對M2糖酵解限速酶活性的影響

與M0 組相比，M2 組HK 和PK 酶活性均升高（P＜0.05）；與M2組相比，M2+4OI-H組HK和PK酶活性均降低（P＜0.05）。結(jié)果顯示，M2 極化后糖酵解水平增加，4OI干預后降低M2糖酵解水平，見圖3。

圖3 糖酵解相關(guān)酶活性比較

2.4 4OI干預對M2脂肪酸氧化限速酶基因表達的影響

與M0 組相比，M2 組CPT-1αmRNA 水平升高（P＜0.01）；與M2 組相比，M2+4OI-H 組CPT-1αmRNA 水平進一步升高（P＜0.01）。結(jié)果顯示，M2極化后CPT-1αmRNA表達水平增加，4OI干預后可進一步提高M2CPT-1αmRNA表達水平，見圖4。

圖4 CPT-1α mRNA表達水平比較

2.5 4OI干預對M2線粒體呼吸鏈代謝酶活性的影響

與M0組相比，M2組線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性水平升高（P＜0.05）；與M2組相比，M2+4OI-H組中線粒體呼吸鏈相關(guān)酶活性水平無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)果顯示，M2 極化后線粒體呼吸鏈代謝酶活性增加，4OI干預后不影響M2線粒體呼吸鏈代謝酶活性，見圖5。

圖5 線粒體呼吸鏈代謝酶活性水平比較

3 討論

Mφ 在炎癥微環(huán)境中可極化為M1 和M2 型。M1 通過釋放IL-1β、IL-6 等介導炎癥反應；M2 通過分泌IL-10、CCL22等介導抗炎和組織修復[7]。在本研究中，與M0 組相比，M2 組細胞偽足形成和呈梭形樣改變，同時M2 極化標志物mRNA 表達量上升。4OI 作為ITA 衍生物在活化的Mφ 內(nèi)可轉(zhuǎn)化為ITA，通過親電應激反應激活Nrf2，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用[8]。文獻報道，肝癌細胞HepG2 來源的乳酸可激活Nrf2 使Mφ 向M2 樣表型傾斜[9]。在小鼠急性肝損傷模型中，4OI 飼喂抑制Mφ 從而減輕肝損傷[10]。Katharina 等[11]用4OI 處理THP-1 誘導的M2型Mφ 24 h，發(fā)現(xiàn)促炎因子TNF-α和M2抑炎極化標志物PPAR-γ和IL-10表達均下降，但IL-1β表達增加，這與本研究結(jié)果類似。本研究結(jié)果顯示，4OI可降低M2 型極化標志物mRNA 水平。Runtsch 等[12]認為4OI是通過降低“M1-M2”譜中的所有Mφ功能來發(fā)揮抗炎作用，4OI預處理BMDM后誘導為M2，4OI 可抑制JAK1/STAT6 通路降低M2 的極化水平。

免疫代謝重編程在M1 和M2 極化中有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[13]。M1 的能量供應特征是增加有氧糖酵解；M2 的能量供應特點是增加葡萄糖攝取和脂肪酸氧化水平，具備完整的三羧酸循環(huán)維持的高水平氧化磷酸化[14]。IL-4 刺激小鼠Mφ 極化為M2 過程中糖酵解水平上升，參與M2 型的極化供能[15]。本研究結(jié)果顯示，M0極化為M2后，糖酵解限速酶HK和PK 活性增加，脂肪酸氧化限速酶CPT-1αmRNA水平增加，線粒體呼吸鏈酶活性增加，提示M2極化過程中糖酵解和脂肪酸氧化共同參與供能。文獻報道，4OI抑制LPS誘導的小鼠骨髓來源Mφ活化，并抑制細胞糖酵解[4]。Nrf2敲除的小鼠中長鏈脂肪酸和短鏈脂肪酸的脂肪酸氧化水平受到抑制[16]。在本研究中，4OI 抑制M2糖酵解水平，并進一步增加脂肪酸氧化水平和維持線粒體呼吸代謝酶活性水平，這提示細胞的氧化磷酸化水平被維持穩(wěn)定水平。LPS 構(gòu)建的膿毒性心臟病模型中，松果堿通過上調(diào)心肌細胞Nrf2 水平促進脂肪酸氧化水平和三羧酸周期從而保護氧化磷酸化水平穩(wěn)定[17]。結(jié)合本研究結(jié)果，4OI作為Nrf2的激活劑，其可能通過抑制糖酵解水平和促進脂肪酸氧化，以維持線粒體呼吸代謝酶活性水平和氧化磷酸化水平穩(wěn)定，繼而保持M2能量代謝特征和極化穩(wěn)定，避免M2過度極化導致功能失調(diào)。

綜上所述，4OI抑制M2糖酵解引起細胞內(nèi)糖代謝發(fā)生重編程，降低IL-4 誘導的M2 極化標志物表達；伴隨進一步提高脂肪酸氧化水平，這可能作為能量補充以抵消糖酵解受抑制導致的能量缺失，從而維持線粒體呼吸鏈代謝酶活性和氧化磷酸化水平的穩(wěn)定，保持M2 極化代謝特征狀態(tài)，避免M2 的過度極化。這可能是4OI作為免疫訓練調(diào)節(jié)劑介導抗炎作用的新機制，本研究為ITA 及其衍生物治療Mφ相關(guān)炎癥性疾病提供新的科學依據(jù)。