肝細(xì)胞癌差異表達(dá)的癌—睪丸抗原篩選及表達(dá)初步驗(yàn)證*

李曉瑩，劉 暢，李 鑫，薛春紅，農(nóng)蔚霞，葛盈盈，張慶梅，謝小薰，羅 彬Δ，曾麒燕

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；3.第一附屬醫(yī)院；4.廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的75%～85%，是第二大腫瘤致死病因[1]。HCC 惡性程度高，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移且發(fā)病隱匿、進(jìn)展快，多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期，預(yù)后差[2]，因此急需探尋新的治療方法。癌—睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）是一類在腫瘤中表達(dá)，而在除睪丸以外的正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原。因其腫瘤特異性和免疫原性，成為腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，CTA參與腫瘤的發(fā)生，可作為腫瘤的早期診斷標(biāo)記[3]，部分CTA作為腫瘤抗原疫苗，如NY-ESO-1,MAGE-A3等應(yīng)用于臨床治療已取得一定療效[4]，這表明CTA在腫瘤診斷和免疫治療等具有應(yīng)用前景。目前，大部分CTA在HCC 中的功能還不清楚，因此有必要進(jìn)一步尋找與HCC 密切相關(guān)的CTA。本研究首先通過生物信息學(xué)方法，篩選出在HCC中差異表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)的CTA，然后分析它們?cè)贖CC 中的功能，并初步驗(yàn)證這些CTA在HCC中的表達(dá)情況，旨在為后續(xù)深入研究HCC免疫靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)患者32 例[男28 例，女4 例；年齡32～65 歲，平均（44.5±9.2）歲]HCC 組織及其中10 例配對(duì)的癌旁組織，組織離體后取材置于液氮保存。Edmondson-Steinner 法病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)0 例，Ⅱ級(jí)22 例，Ⅲ級(jí)9，Ⅳ級(jí)1 例。TNM 分期：Ⅰ期0 例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期2例，Ⅳ期20例。同時(shí)，收集所有患者的臨床相關(guān)資料。標(biāo)本收集經(jīng)患者知情同意和廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：20220145）。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 基因表達(dá)分析 利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）在線分析CT抗原數(shù)據(jù)庫（http://www.cta.lncc.br/）中258 個(gè)CTA在HCC 中的表達(dá)情況，Log2（Fold Change）＞0、P＜0.05被認(rèn)為是表達(dá)上調(diào)基因，Log2（Fold Change）＜0、P＜0.05被認(rèn)為是表達(dá)下調(diào)基因，并以Log2（Fold Change）＞1，P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，獲取HCC 中顯著差異表達(dá)CTA，結(jié)果以R語言繪制火山圖可視化。

1.2.2 生存分析 采用Linkedomics 數(shù)據(jù)庫（http://www.linkedomics.org/login.php）對(duì)顯著差異表達(dá)CTA進(jìn)行Cox Regression生存分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，獲取與HCC預(yù)后相關(guān)的CTA。

1.2.3CTA基因功能分析 采用Linkedomics 數(shù)據(jù)庫以相關(guān)系數(shù)r＞0.3 為標(biāo)準(zhǔn)獲取HCC 中顯著差異表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)的CTA共表達(dá)基因，用DAVID在線工具（https：//david.ncifcrf.gov）對(duì)CTA共表達(dá)基因進(jìn)行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，預(yù)測CTA在HCC 中的功能，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果以R語言繪制柱狀圖和氣泡圖可視化。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測HCC 中NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17 mRNA的表達(dá)

采用RNA 提取試劑盒（南京諾唯贊公司，#RC101-01）提取組織總RNA。用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊公司，#R323-0-1），將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)cDNA。SYBR Green 染料法行qPCR（南京諾唯贊公司，#Q711-02）檢測，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。所用引物由生工生物（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 qPCR擴(kuò)增引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用Fisher 確切概率法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC中差異表達(dá)的CTA基因篩選

通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫查找258 個(gè)CTA基因在HCC中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)63個(gè)CTA表達(dá)上調(diào)，15個(gè)CTA表達(dá)下調(diào)（圖1）；篩選表達(dá)上調(diào)、排名靠前的8個(gè)CTA，即NUF2、PBK、ATAD2、KIF2C、OIP5、SPAG4、CASC5和SPA17，這些CTA在癌組織中的表達(dá)均高于正常組織（P＜0.05）（圖2）。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析258個(gè)CTA在HCC中的表達(dá)

圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析8個(gè)CTA在HCC和正常肝組織中的表達(dá)

2.2 差異表達(dá)CTA與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

為進(jìn)一步評(píng)估顯著差異CTA與HCC 預(yù)后的關(guān)系，使用Linkedomics數(shù)據(jù)庫對(duì)上述8個(gè)CTA進(jìn)行生存分析（圖3），發(fā)現(xiàn)NUF2、PBK、KIF2C、OIP5和SPA17等5 個(gè)CTA均與HCC 患者的臨床預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），CTA 高表達(dá)者的總生存期低于低表達(dá)者。

圖3 Linkedomics數(shù)據(jù)庫分析5個(gè)CTA在HCC中的生存曲線

2.3 HCC 中NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17 mRNA的表達(dá)分析

qRT-PCR 結(jié)果顯示，HCC 中NUF2和PBKmRNA的表達(dá)高于癌旁組織（P＜0.05），見圖4。

圖4 RT-qPCR檢測NUF2、PBK、KIF2C、OIP5和SPA17 mRNA在HCC和癌旁組織中的表達(dá)

2.4 NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17功能預(yù)測

GO和KEGG富集分析結(jié)果：與NUF2表達(dá)正相關(guān)的基因1 907個(gè)；與PBK表達(dá)正相關(guān)的基因1 486個(gè)；與KIF2C表達(dá)正相關(guān)的基因2 242個(gè)；與OIP5表達(dá)正相關(guān)的基因1 582 個(gè)；與SPA17 表達(dá)正相關(guān)基因230 個(gè)，主要參與轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控、細(xì)胞分裂、纖毛形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)過程，涉及細(xì)胞周期、剪接體及RNA運(yùn)輸、軸突導(dǎo)向等信號(hào)通路，見圖5。

圖5 NUF2、PBK、KIF2C、OIP5和SPA17的GO和KEGG分析

2.5 NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17與HCC臨床參數(shù)的關(guān)系

以癌組織CTAmRNA 表達(dá)中位數(shù)為界分為高表達(dá)組和低表達(dá)組（高于中位數(shù)為高表達(dá)組，否則為低表達(dá)組），分析CTA表達(dá)水平與HCC患者性別、年齡、HBV 感染、腫瘤大小、血清甲胎蛋白（AFP）、肝硬化、WHO 分級(jí)、TNM 分期等臨床參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明均無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表2 NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17 mRNA的表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)的關(guān)系

3 討論

HCC是廣西高發(fā)性疾病，近年發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[5]，因此急需新的輔助療法，腫瘤免疫治療因有較好的特異性和較小的副作用而成為研究熱點(diǎn)。近年來，CTA日益受到關(guān)注。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，篩選出HCC中顯著差異表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)的5 個(gè)CTA：NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17；進(jìn)一步對(duì)這5 個(gè)CTA進(jìn)行功能預(yù)測，隨后進(jìn)行CTA表達(dá)的初步驗(yàn)證，并探討CTA水平與HCC臨床參數(shù)的關(guān)系。

NUF2（NDC80 kinetochore complex component）也稱為CT106，作為細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白家族，主要參與動(dòng)粒—微管黏附、細(xì)胞有絲分裂等過程，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，NUF2的缺失可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯引發(fā)細(xì)胞凋亡，并明顯抑制HCC 生長[7]。Liu 等[8]報(bào)道，NUF2在HCC中高表達(dá)，可作為HCC不良預(yù)后的標(biāo)志物。本研究也表明NUF2在HCC組織中高表達(dá)，生物信息學(xué)分析顯示NUF2與HCC預(yù)后相關(guān)，推測其可能通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。

PBK（PDZ-binding kinase）也稱為CT84，是MAPKK 家族成員，能與cdk1/cyclin、P53、NF-κB 等相互作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[9]。Yang 等[10]報(bào)道，上調(diào)PBK表達(dá)能通過ETV4-uPAR信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。另一研究表明，HCC中PBK高表達(dá)與腫瘤大小、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，下調(diào)PBK表達(dá)能抑制HCC 的生長和轉(zhuǎn)移[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)PBK在HCC中高表達(dá)；PBK與臨床病理參數(shù)無關(guān)，可能與樣本量例數(shù)較少有關(guān)。

KIF2C（kinesin family member 2C）也稱為CT139，主要參與微管解聚、微絲與著絲粒位點(diǎn)結(jié)合及染色體分離，從而調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[12]。OIP5（Opa interacting protein 5）又稱CT86，主要參與調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂過程,對(duì)維持著絲粒的結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用[13]。SPA17（sperm autoantigenic protein 17），在CTA家族中又名CT22，是一種透明帶相互作用蛋白，主要存在于精子尾部的纖維鞘中，參與精子成熟和受精過程[14]。研究發(fā)現(xiàn)KIF2C、OIP5和SPA17均高表達(dá)于HCC，其中KIF2C和OIP5與HCC 的惡性程度呈正相關(guān)關(guān)系，SPA17與HCC 的分化有關(guān)，且KIF2C和OIP5與HCC 不良預(yù)后相關(guān)[15-17]。本研究通過RTqPCR檢測發(fā)現(xiàn)KIF2C、OIP5、SPA17在HCC與癌旁組織中表達(dá)無顯著差異，可能與樣本數(shù)較少和組織異質(zhì)性等因素有關(guān)。

本研究經(jīng)過生物信息學(xué)篩選并初步分析了HCC 中高表達(dá)的CTA，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NUF2和PBK在HCC 組織中的表達(dá)高于癌旁組織，這提示NUF2和PBK有望成為HCC 潛在治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)尚存在一些不足之處，如病例樣本量較小等，后期需進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本量，并結(jié)合HCC患者預(yù)后進(jìn)行分析，深入探討其分子機(jī)制，以期為HCC 的診療提供新的思路。