氨基酸處理對(duì)水培韭菜產(chǎn)量、品質(zhì)及風(fēng)味的影響

韓貝貝 王寶駒 佟 靜 劉明池 武占會(huì) 孟艷玲 劉 寧*

〔1 河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，北京 100097；3 國家蔬菜工程技術(shù)研究中心，北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京100097〕

韭 菜（Rottl.ex Spreng.）是石蒜科（Amaryllidaceae）蔥屬的多年生宿根蔬菜（Saito，1990；李延龍 等，2020）。韭菜起源于我國華北地區(qū)，栽培歷史悠久，全國各地均有分布，常年種植面積達(dá)40 萬hm以上，在蔬菜生產(chǎn)和周年供應(yīng)中占據(jù)重要地位（王娟娟 等，2020）。近年來，水培韭菜技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上緩解了長(zhǎng)期困擾韭菜產(chǎn)業(yè)的農(nóng)殘超標(biāo)和病蟲害問題，但與傳統(tǒng)土壤栽培韭菜相比，水培韭菜的風(fēng)味稍遜一籌，其原因在于風(fēng)味物質(zhì)積累量不足（Liu et al.，2021）。因此，如何通過栽培技術(shù)創(chuàng)新提升水培韭菜的風(fēng)味，成為當(dāng)前水培韭菜產(chǎn)業(yè)的核心問題之一。

韭菜葉片含有豐富的有機(jī)硫化合物S-烴基半胱氨酸亞砜〔S-alk（en）yl cysteine sulfoxide，CSO〕，這類風(fēng)味前體物質(zhì)構(gòu)成了韭菜特征香氣和醫(yī)療保健功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)（Liu et al.，2021）。同位素示蹤研究證實(shí)硫酸鹽首先同化生成半胱氨酸（Takahashi，2010，2019），經(jīng)過多步生化反應(yīng)形成谷胱甘肽及其衍生物（Galant et al.，2011），如S-甲基谷胱甘肽、S-（2-羧丙基）-谷胱甘肽等，繼而生成γ-谷氨酰胺-S-烯丙基半胱氨酸、γ-谷氨酰胺-S-丙烯基半胱氨酸、γ-谷氨酰胺-S-甲基半胱氨酸等一系列γ-谷氨酰胺肽衍生物，最終經(jīng)依賴黃素的單加氧酶（FMO）催化的硫氧化（S-oxygenation）反應(yīng)，生成不同的CSO 分子（Jones et al.，2004）。FMO 負(fù)責(zé)催化立體選擇性較高的硫單加氧反應(yīng)，因而該過程可能是CSO 合成限速反應(yīng)（Yoshimoto et al.，2015）。在加工韭菜葉片時(shí)，CSO 經(jīng)蒜氨酸酶催化水解和隨后的自發(fā)降解反應(yīng)，生成一系列具有刺激性氣味的揮發(fā)性有機(jī)硫化物，釋放出蔥屬蔬菜的特征香氣（Yoshimoto &Saito，2019）。研究表明，絲氨酸直接參與半胱氨酸的合成過程，纈氨酸是CSO 合成的中間產(chǎn)物γ-谷氨酰胺-S-（2-羧丙基）-半胱氨酸的反應(yīng)底物，谷氨酸是谷胱甘肽的合成起始底物之一，因而這些氨基酸在CSO 生物合成過程中起著重要作用（Jones et al.，2004，Liu et al.，2021）。綜上所述，CSO 生物合成過程至少涉及纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酸參與的生化反應(yīng)過程，而FMO 在韭菜CSO合成過程中起著至關(guān)重要的作用（Rabinowitch &Currah，2002；Jones et al.，2004；Yoshimoto et al.，2015）。

氨基酸作為一種有機(jī)氮源可以被作物直接吸收利用，外源施用氨基酸可以顯著提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆性（張連秋 等，2014；Teixeira et al.，2018）。大量研究證實(shí)，氨基酸等小分子物質(zhì)作為水溶肥料，不僅能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，還能顯著提高茄子、芹菜、豇豆、番茄等蔬菜的品質(zhì)，作物凈光合速率、葉綠素含量、株高、莖粗等指標(biāo)顯著高于對(duì)照組（曹洪鳳 等，2010；Koukounaras et al.，2013；王軍 等，2014；王蓓 等，2017）。目前，氨基酸肥料在韭菜生產(chǎn)中的應(yīng)用報(bào)道較少，因此本試驗(yàn)利用水培韭菜生產(chǎn)系統(tǒng)，以苗齡為3 年的791 韭菜為試驗(yàn)材料，通過向水培營養(yǎng)液中添加CSO 合成相關(guān)的4 種氨基酸（纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和谷氨酸），研究它們對(duì)水培韭菜生長(zhǎng)、產(chǎn)量、品質(zhì)及風(fēng)味的影響，以期明確能夠促進(jìn)韭菜CSO 積累，提升水培韭菜風(fēng)味的氨基酸。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所連棟玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，供試韭菜品種為791。采用新型韭菜水培系統(tǒng)，架床使用72 孔無底栽培格盤（54 cm ×28 cm），營養(yǎng)液使用千葉農(nóng)式蔥配方（杜紅艷 等，2015；季延海 等，2017）：Ca（NO）1.0 mmol ·L、KNO4.0 mmol·L、NHNO2.0 mmol·L、KHPO2.0 mmol·L、（NH）SO1.0 mmol·L、MgSO·7HO 1.0 mmol·L。在此配方基礎(chǔ)上，參考水培營養(yǎng)液添加氨基酸的試驗(yàn)（Khan et al.，2019），將營養(yǎng)液中氨基酸處理?xiàng)l件分別設(shè)定為添加1 mmol·L纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和谷氨酸，以不添加氨基酸的千葉農(nóng)式蔥配方營養(yǎng)液為對(duì)照（CK）。試驗(yàn)以3 年生的韭菜為研究材料，每個(gè)處理使用3 個(gè)栽培格盤的韭菜，設(shè)置3 次重復(fù)。營養(yǎng)液pH 值控制在6.0 ± 0.3 范圍，每周測(cè)1 次EC和pH 并及時(shí)使用相應(yīng)的營養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)充和更換。試驗(yàn)于2021 年4 月3 日、5 月12 日和6 月19 日分別收獲第1、2、3 茬韭菜，第1 茬韭菜采收后開始進(jìn)行不同氨基酸處理，并在第2 茬采收時(shí)測(cè)定各項(xiàng)生長(zhǎng)、生理及品質(zhì)指標(biāo)。

1.2 生長(zhǎng)、生理指標(biāo)的測(cè)定

每個(gè)處理隨機(jī)選取10 株韭菜進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置3 次重復(fù)。用電子游標(biāo)卡尺測(cè)定韭菜假莖粗，用直尺測(cè)量韭菜株高、葉長(zhǎng)、葉寬，觀察葉片數(shù)。采用乙醇浸提比色法測(cè)定韭菜葉片光合色素含量，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測(cè)定韭菜根系活力（李合生，2000），采用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定韭菜葉片可溶性糖含量（張以順 等，2009），采用2，6-二氯酚靛酚鈉滴定法測(cè)定韭菜葉片VC 含量（蔡慶生，2013），采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定韭菜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量（李合生，2000），采用水楊酸法測(cè)定韭菜葉片硝酸鹽含量（曹建康 等，2007）。

每個(gè)處理隨機(jī)選取5 株韭菜測(cè)定單株干鮮質(zhì)量，3 次重復(fù)。鮮質(zhì)量直接用分析天平稱量，干質(zhì)量測(cè)定在105 ℃殺青，75 ℃烘干至恒重后稱重記錄。單位面積理論產(chǎn)量是根據(jù)收獲的3 個(gè)水培盤（每盤面積0.151 2 m）內(nèi)的韭菜產(chǎn)量進(jìn)行估算，計(jì)算公式如下。

理論產(chǎn)量〔kg ·（667 m）〕=單個(gè)格盤收獲韭菜產(chǎn)量（kg）× 667 m/單個(gè)格盤面積

1.3 韭菜辛辣度的測(cè)定

韭菜辛辣度測(cè)定參考大蒜和洋蔥的檢測(cè)方法，通過測(cè)定CSO 水解后酶促丙酮酸的含量，評(píng)估蔥屬作物的辛辣程度（Liu et al.，2021）。每個(gè)處理取4～6 株新鮮韭菜葉片中段共0.5 g，混成一個(gè)樣品放入離心管中，以未添加氨基酸營養(yǎng)液的水培韭菜為CK1，以土壤栽培的韭菜為CK2，3 次重復(fù)。在離心管中加入2 mL 含5% TCA 的磷酸緩沖液（pH 6.5），經(jīng)高通量植物勻漿提取儀研磨成漿，用臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)10 000 r·min離心后取上清液，樣品組按比例加入10 倍稀釋的韭菜組織上清液、0.012 5% 2，4-二硝基甲苯、0.6 mol·L氫氧化鈉（比例為3∶1∶5），空白組加入與韭菜組織上清液等體積的蒸餾水，室溫反應(yīng)5 min 后用BioTek 酶標(biāo)儀進(jìn)行比色測(cè)定吸光值，檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm。利用丙酮酸鈉溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算韭菜葉片的酶促丙酮酸含量，測(cè)定其辛辣度。

1.4 韭菜FMO 基因表達(dá)量測(cè)定

每個(gè)處理取韭菜的第4 片葉，每5 株的葉片材料混成一個(gè)樣品，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于RNA 提取。使用EasyPure? Plant RNA Kit 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取韭菜葉片總RNA，隨后用TransScript? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Mater Mix試 劑 盒〔Toyobo（shanghai）Biotech CO.，Ltd.〕進(jìn)行基因表達(dá)分析。qRT-PCR 反應(yīng)體系為：SYBR Green Mix（2×）10.0 μL、上下游引物（10 μmol ·L）各0.5 μL、cDNA 1.0 μL、補(bǔ)足滅菌ddHO 至20.0 μL；qRT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，選用（）為內(nèi)參基因，采用2法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量（Tong et al.，2021）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0 以Tukey 法進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性，采用EXCEL 2016 軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氨基酸處理對(duì)韭菜生長(zhǎng)的影響

從表1 可以看出水培韭菜營養(yǎng)液添加不同氨基酸后，株高、假莖粗、葉長(zhǎng)、葉片數(shù)、根系活力等多數(shù)指標(biāo)優(yōu)于對(duì)照，其中以谷氨酸處理的韭菜表現(xiàn)最佳，株高、假莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)和根系活力分別較對(duì)照提高了30.6%、47.2%、29.7%、34.8%、16.2%和166.9%，且與對(duì)照差異顯著。絲氨酸、纈氨酸對(duì)水培韭菜生長(zhǎng)也有一定的促進(jìn)作用，而半胱氨酸對(duì)韭菜生長(zhǎng)影響不大。

表1 不同氨基酸處理對(duì)韭菜生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.2 不同氨基酸處理對(duì)韭菜光合色素含量的影響

由表2 可知，纈氨酸、絲氨酸和半胱氨酸處理韭菜的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素a+b、葉綠素a/b 等生理指標(biāo)均與對(duì)照差異不顯著。但谷氨酸處理的韭菜葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素a+b 含量均顯著低于對(duì)照，分別較對(duì)照降低了41.2%、15.0%、42.8%和38.7%。

表2 不同氨基酸處理對(duì)韭菜光合色素含量的影響

2.3 不同氨基酸處理對(duì)韭菜品質(zhì)的影響

由表3 可以看出，谷氨酸處理顯著促進(jìn)了VC積累，韭菜葉片的VC 含量比對(duì)照增加50.9%。添加氨基酸處理對(duì)韭菜可溶性糖、可溶性蛋白含量影響不大。纈氨酸處理導(dǎo)致葉片硝酸鹽含量顯著升高，而其他3 種氨基酸對(duì)葉片的硝酸鹽含量影響不大。

表3 不同氨基酸處理對(duì)韭菜品質(zhì)的影響

2.4 不同氨基酸處理對(duì)韭菜干鮮質(zhì)量和產(chǎn)量的影響

由表4 可知，氨基酸處理對(duì)韭菜鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響趨勢(shì)完全一致。谷氨酸處理能顯著促進(jìn)韭菜單株干、鮮質(zhì)量增加，分別比對(duì)照增加44.4%、42.2%；半胱氨酸處理導(dǎo)致韭菜干、鮮質(zhì)量顯著降低，分別比對(duì)照降低43.4%、49.5%。

表4 不同氨基酸處理對(duì)韭菜單株干鮮質(zhì)量和產(chǎn)量的影響

韭菜產(chǎn)量的變化趨勢(shì)為：谷氨酸＞纈氨酸＞絲氨酸＞對(duì)照＞半胱氨酸，其中谷氨酸、纈氨酸處理的產(chǎn)量顯著高于對(duì)照，分別實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)41.5%、33.1%，而半胱氨酸處理的產(chǎn)量顯著低于對(duì)照，比對(duì)照降低17.6%。

2.5 不同氨基酸處理的韭菜辛辣度

由圖1 可以看出，谷氨酸處理的韭菜酶促丙酮酸含量達(dá)4.3 μmol·g（FW），辛辣度較對(duì)照提高70.9%，與土壤韭菜辛辣度相近。半胱氨酸和纈氨酸處理也能提高韭菜辛辣度，但與對(duì)照差異不顯著。

圖1 不同氨基酸處理對(duì)韭菜辛辣度的影響

2.6 不同氨基酸處理對(duì)韭菜FMO 基因表達(dá)的影響

為明確氨基酸處理對(duì)韭菜FMO 基因表達(dá)的影響，本試驗(yàn)利用qPCR 方法研究了已知的6 個(gè)韭菜FMO 基因在4 種氨基酸處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，__和__表達(dá)不受4 種氨基酸處理的影響，其他4 個(gè)韭菜FMO 基因的表達(dá)至少響應(yīng)1 種氨基酸處理（圖2）。值得注意的是，與對(duì)照相比，谷氨酸處理能促進(jìn)4 個(gè)FMO 基因（__、__、__和__）表達(dá)量顯著增加，而半胱氨酸僅能顯著促進(jìn)1 個(gè)FMO 基因（__）的表達(dá)。

圖2 4 種氨基酸處理對(duì)韭菜FMO 基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論與討論

水培韭菜的辛辣度不及土壤栽培韭菜，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的購買意愿和農(nóng)戶的種植收益，因此如何通過栽培技術(shù)創(chuàng)新提升水培韭菜的風(fēng)味成為當(dāng)前一項(xiàng)重要的產(chǎn)業(yè)需求。構(gòu)成韭菜風(fēng)味的主要成分是一類有機(jī)硫化物CSO，其合成過程需要半胱氨酸、絲氨酸、纈氨酸、谷氨酸參與，因此筆者在水培韭菜營養(yǎng)液中添加上述4 種氨基酸，研究了它們對(duì)韭菜辛辣度及生長(zhǎng)、生理指標(biāo)的影響。

不同作物對(duì)氨基酸肥料的需求存在顯著差異。李磊等（2019）發(fā)現(xiàn)適宜濃度的氨基酸水溶肥作用在辣椒現(xiàn)蕾期時(shí)能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，辣椒果實(shí)的氨基酸含量有所增加，表明植物不僅可以吸收氨基酸，還可以將外源氨基酸轉(zhuǎn)換利用，從而提高植物體內(nèi)氨基酸含量。張政（2005）以5 種具有代表性的氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸和谷氨酸）進(jìn)行黃瓜營養(yǎng)效應(yīng)的試驗(yàn)，結(jié)果表明丙氨酸和甘氨酸能顯著提高黃瓜的生長(zhǎng)指標(biāo)，而賴氨酸處理下黃瓜干鮮質(zhì)量甚至低于對(duì)照。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，谷氨酸、絲氨酸和纈氨酸處理能促進(jìn)水培韭菜生長(zhǎng)，其中谷氨酸的促生效果最好，然而半胱氨酸對(duì)韭菜生長(zhǎng)基本無影響。由此可見，韭菜更傾向利用谷氨酸，在營養(yǎng)液中添加谷氨酸能促進(jìn)韭菜生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加氨基酸對(duì)水培韭菜的光合色素合成影響不大，韭菜的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素a+b、葉綠素a/b 含量均低于對(duì)照或與對(duì)照無顯著差異。這與前人的研究結(jié)果基本一致，如在以硝酸鹽為氮源的培養(yǎng)基中，谷氨酸促進(jìn)了小球藻的生物量但是葉綠素含量沒有變化（劉學(xué)銘和梁世中，1999）。推測(cè)這可能是由于試驗(yàn)添加的4 種氨基酸并不直接參與光合作用代謝途徑，因而對(duì)光合色素合成過程影響輕微。

根系的生長(zhǎng)情況直接影響植株生長(zhǎng)特性和肥水吸收能力。本試驗(yàn)中，水培韭菜在添加絲氨酸、谷氨酸和纈氨酸的營養(yǎng)液中根系活力均顯著高于對(duì)照，反映它們能促進(jìn)水培韭菜更好生長(zhǎng)。同時(shí)，添加谷氨酸、纈氨酸使韭菜產(chǎn)量顯著提高，其中谷氨酸的增產(chǎn)效果最為顯著。因此，結(jié)合考慮生長(zhǎng)、生理和產(chǎn)量指標(biāo)，在水培韭菜營養(yǎng)液中添加谷氨酸，有利于改善水培韭菜的生長(zhǎng)狀況。

外源施用4 種氨基酸對(duì)韭菜的營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)影響不大，但能影響韭菜的風(fēng)味。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)僅谷氨酸處理能顯著提高水培韭菜的VC 含量，然而可溶性糖、可溶性蛋白等指標(biāo)與對(duì)照差異不顯著，其他3 種氨基酸處理對(duì)水培韭菜的營養(yǎng)指標(biāo)影響輕微；谷氨酸處理能顯著提高水培韭菜酶促丙酮酸含量，使水培韭菜變得更為辛辣，這表明谷氨酸能促進(jìn)CSO 的合成和積累。

為探究氨基酸處理提升水培韭菜風(fēng)味的機(jī)理，進(jìn)一步分析了CSO 合成關(guān)鍵基因FMO 表達(dá)的變化情況。筆者前期在韭菜組織特異性轉(zhuǎn)錄組鑒定到6個(gè)韭菜葉片組織中豐度較高的韭菜FMO 基因，它們是編碼CSO 合成限速反應(yīng)的一類氧化酶基因（Liu et al.，2021）。qRT-PCR 試驗(yàn)表明，谷氨酸能促進(jìn)其中4 個(gè)FMO 基因的表達(dá)，效果明顯好于其他3種氨基酸處理，從而更有利于韭菜合成風(fēng)味物質(zhì)前體分子，提升韭菜風(fēng)味。因此綜合考慮生長(zhǎng)、生理和營養(yǎng)風(fēng)味指標(biāo)，在營養(yǎng)液中添加1 mmol·L谷氨酸，能有效改善水培韭菜品質(zhì)，提高產(chǎn)量，并有效提升其辛辣風(fēng)味。