杭州蘆筍莖枯病病原鑒定與防治

石延霞 李寶聚* 王 朵 張旭娟 施建軍 路雅靜 謝學文 柴阿麗 李 磊

（1 中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 杭州佳惠農業開發有限公司，浙江杭州 311200）

蘆筍（L.）也稱石刁柏、龍須菜，素有“蔬菜之王”的美譽，是世界十大名菜之一，我國是世界上蘆筍第一大生產國和出口國。隨著蘆筍種植面積的擴大，土傳病害發生率亦逐漸上升，常見的病害有莖枯病〔（Sacc.）Bubak〕、枯 萎 病（）、根腐病（spp.）等，可種傳、種苗傳或者土傳（張岳平 等，2012），尤其蘆筍莖枯病（asparagus stem blight）是一種全球性的毀滅性病害，在中國、日本、泰國等國家均有發生（Sonoda et al.，1997；Shanmugam et al.，2001；Zhang et al.，2017）。我國由于氣候原因蘆筍莖枯病普遍發生，3 年以上的蘆筍發病率幾乎達100%，且南方比北方發生率高（Yang et al.，2016）。近年來，尤其浙江、江蘇等地蘆筍種植區莖枯病發生嚴重，一旦染病，植株迅速死亡，降低了蘆筍的品質和產量，給當地農業生產帶來巨大的損失，嚴重影響了出口創匯。

蘆筍莖枯病最適發病溫度為23～26 ℃，病原菌分生孢子器遇水后釋放分生孢子，隨著風雨等擴散傳播，因此多雨、高濕環境更利于該病害的發生和流行（苗華民 等，1991；賈廷祥 等，1992）。2018 年以來，浙江省杭州市佳慧蘆筍種植基地莖枯病發生日趨嚴重，與當地氣候條件和未及時采取防控措施，錯過了最佳防治時期有關。目前防治該病害的主要手段仍然是化學藥劑防治，本試驗對杭州蘆筍莖枯病病原菌進行鑒定，探究不同藥劑對其防治效果，以利于合理用藥，有效防控蘆筍莖枯病。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

2018 年10 月至2020 年10 月，在浙江杭州佳慧蘆筍種植基地采集具有明顯發病癥狀的蘆筍莖稈，帶回實驗室進行致病菌分離，共分離得到病原菌15 株，編號依次為LS18102101、LS18102103、LS18102104、LS18102106、LS18102108、LS18102109、LS18102110、LS18102113、LS18102115、LS18102116、LS18102123、LS18102124、LS18102125、LS18102126、LS18102136。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆筍莖枯病病原菌的分離、純化 選取病癥發生明顯的蘆筍莖部，在病健交界處切取大小約5 mm × 5 mm 的莖部組織，用75%酒精消毒30 s，置于無菌水中清洗3 次；晾干后置于PDA 培養基上，于27 ℃培養箱內培養。3 d 后在無菌環境下挑取新長出的菌落邊緣菌絲，移至新的PDA 培養基上進行多次純化培養，直至菌落無雜菌。

1.2.2 蘆筍莖枯病病原菌的形態學觀察 將純化后的病原菌轉接至新的PDA 培養基上，25 ℃恒溫條件下培養7 d 后，觀察菌落形態及顏色等特征。待10 d 后病原菌產生分生孢子器，用接種環輕輕刮拭培養基分生孢子器表面制片，在顯微鏡下觀察分生孢子形態、顏色等特征。

1.2.3 蘆筍莖枯病病原菌的分子生物學鑒定 利用真菌DNA 提取試劑盒（北京酷來搏科技有限公司），在分離出的15 株病原菌中，隨機選取8 株提取病原菌DNA，分別采用真菌通用引物ITS1/ITS4（White et al.，1990）和特異性引物SF/SR（杜宜新 等，2018）對病原菌DNA 進行PCR 擴增。PCR反應體系（50 μL）為：2 ×Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）26 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各2 μL，ddHO 補足至50 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共30個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物送北京博邁德基因技術有限公司進行測序。將獲得的ITS 基因序列在NCBI 中比對，從GenBank 下載相關序列，用MEGA 7.0 軟件進行親緣關系分析，在8 株病原菌中隨機選擇3 株構建系統發育樹。

1.2.4 蘆筍莖枯病病原菌致病性測定 按照柯赫氏法則，選取盆栽半年生蘆筍幼苗，對分離出的15株病原菌進行接種驗證及致病性測定，每處理15株。將純化培養后的分生孢子濃度調整為1 × 10個 ·mL（楊迎青 等，2012），在蘆筍苗期，刺傷莖部進行噴霧接種，每處理噴施30 mL，以噴施清水為空白對照。待接種部位發病后，對發病部位的病斑再次進行病原菌分離、純化，觀察菌落、分生孢子器和分生孢子特征，如果與最初分離出的病原菌一致，則可確定為該病原菌。

接種14 d 后，對接種幼苗進行病情調查，計算其病情指數。

按照楊迎青等（2012）的標準進行病情分級：0 級，全株無病斑；1 級，發病面積占總面積6%以下；2 級，發病面積占總面積的6%～10%；3 級，發病面積占總面積的11%～20%；4 級：發病面積占總面積的21%～30%；5 級：發病面積占總面積的30%以上。

病情指數=∑（各級病株數 × 該級代表值）/（調查總株數 ×最高級代表值）× 100

1.2.5 不同藥劑對蘆筍莖枯病病原菌的室內生物活性測定 以菌株LS18102108 為試材，其致病性在15 株病原菌中最強。將該菌株置于PDA 培養基平板上，27 ℃恒溫培養5 d 后，在菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅。含藥培養基的制備：將供試藥劑（表1）配制成母液，然后按照濃度梯度，用加熱融化后約55 ℃的液體PDA 培養基稀釋，各藥劑在PDA培養基中的終濃度分別為0（對照）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg·mL，將直徑5 mm 的菌餅接種于不同濃度含藥培養基平板中心，有菌絲一側向上，每處理重復3 次。接菌后25 ℃黑暗培養，待菌絲長滿含0 μg·mL藥劑的培養基平板時，采用“十”字交叉法測量每處理的菌絲直徑，計算抑制率。

表1 蘆筍莖枯病病原菌室內生物活性測定供試藥劑

抑制率=（對照菌落直徑 -處理菌落直徑）/（對照菌落直徑 -0.5 cm）× 100%

采用Microsoft Excel 軟件對試驗數據進行整理；采用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件，以防治藥劑濃度的對數值為橫坐標，以抑制率的生物幾率值為縱坐標，計算各藥劑的毒力回歸方程和有效中濃度（EC）。

1.2.6 不同藥劑對蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評價 以菌株LS18102108 為試材，參試藥劑及試驗濃度詳見表2。分別將5 種稀釋后的藥劑均勻噴施于半年生盆栽蘆筍幼苗上，每種藥劑噴施30 mL，2 h 后待藥液完全被蘆筍吸收后接種病原菌，方法同1.2.4，設置清水對照。每個處理3 次重復，共30 株。待對照植株發病后，計算病情指數和防效。

表2 蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評價供試藥劑

防效=（對照病情指數 -處理病情指數）/對照病情指數 × 100%

2 結果與分析

2.1 蘆筍莖枯病田間發病癥狀

在浙江杭州佳慧蘆筍種植基地發現的蘆筍莖枯病主要為害植株莖部，嫩莖和嫩枝最易感病（圖1-A）。典型癥狀為：初期，莖稈上出現外緣呈水漬狀的橢圓形小斑；之后病斑逐漸擴大，中間呈灰褐色大斑（圖1-B）；后期，病斑上出現許多散生或呈輪紋狀排列的黑色小粒點（圖1-C）；病斑持續擴展并環繞莖部約一周后，植株莖葉迅速變黃枯死，直至整株死亡（圖1-D）。

圖1 蘆筍莖枯病田間癥狀

2.2 蘆筍莖枯病病原菌形態特征

將獲得的純化菌株在PDA 培養基上25 ℃培養7 d 后，觀察菌落形態。該病原菌菌落平坦，初期為白色，氣生菌絲平鋪（圖2-A）；隨著培養時間延長，菌落呈灰白色或淡黃綠色（圖2-B、C）；分生孢子器形成于子座中，子座黑色，常數個集結成塊，呈球形，成熟后外露于菌絲層，培養后期子實體分泌橘黃色液狀物（圖2-D、E）；分生孢子呈長橢圓形或卵圓形，少數呈梭形，無色，單孢，內有2 個油球（圖2-F）。

圖2 蘆筍莖枯病病原菌形態特征

2.3 蘆筍莖枯病病原菌分子生物學鑒定

采用通用引物ITS1/ITS4 和特異性引物SF/SR 對病原菌DNA 進行擴增，分別獲得長度為650 bp 和401 bp 的目標片段（圖3），獲得的ITS 基因序列在NCBI 上的比對結果與天門冬擬莖點霉（KJ801804.1）的序列同源性為100%。

圖3 蘆筍莖枯病病原菌ITS1/ITS4 和SF/SR 引物擴增結果

將該序列在GenBank 數據庫中比對分析后發現，菌株LS18102101、LS18102108 和LS18102110與世界不同地區的擬莖點霉（）（LC203583.1、LC203582.1、LC333579.1、KJ801804.1、KC456277.1、AB247166.1 和HQ832822.1）遺傳距離接近，均屬于同一分支（圖4）。綜合形態學特征，確定其為天門冬擬莖點霉〔（Sacc.）Bubak〕。

圖4 根據ITS 基因同源性構建系統發育樹

2.4 蘆筍莖枯病病原菌致病性測定

盆栽試驗中，接種病原菌的蘆筍莖葉在接種8 d 后開始發病。發病初期莖稈開始出現病斑，嫩莖上逐漸出現小黑點，之后由于上部缺水葉部變黃，與田間癥狀一致（圖5）。將接種后發病的蘆筍莖部進行組織分離，鏡檢分離出的病原菌與接種的病原菌形態一致，表明分離獲得的病原菌為蘆筍莖枯病致病菌。接種病原菌的植株發病率均為100%，病情指數在34～63 之間，編號LS18102108 的菌株致病性最強，清水對照未發病。

圖5 蘆筍接種莖枯病病原菌發病結果

2.5 不同藥劑對蘆筍莖枯病病原菌的室內生物活性測定

從表3 可以看出，在供試藥劑中，25%吡唑醚菌酯懸浮劑對蘆筍莖枯病病原菌菌絲生長抑制作用最強，在供試濃度下對菌絲完全抑制；75%百菌清可濕性粉劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑和50%異菌脲可濕性粉劑對病原菌菌絲生長的抑制作用均較強，EC值分別為0.13、0.19、2.04、2.24 μg ·mL和2.25 μg·mL。

表3 不同藥劑對蘆筍莖枯病病原菌的室內生物活性測定

2.6 不同藥劑對蘆筍莖枯病活體盆栽藥效評價

從表4 可以看出，25%吡唑醚菌酯懸浮劑的防效最好，達94.56%，與室內生物活性測定結果相符；10%苯醚甲環唑水分散粒劑、75%百菌清可濕性粉劑、50%異菌脲可濕性粉劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑均有不同程度的防治效果，防效分別為59.78%、58.15%、47.82%、44.56%。

表4 不同藥劑對蘆筍莖枯病病原菌的藥效評價

3 結論與討論

本試驗通過對蘆筍發病植株分離得到的病原菌進行顯微形態學觀察、分子生物學鑒定、接種驗證和致病性測定，明確該蘆筍莖枯病病原菌為天門冬擬莖點霉，這與該病害的病原菌已有報道相符（劉克均 等，1991；陳建 等，2020）。

蘆筍莖枯病是蘆筍主要病害，用于防治該病害的化學藥劑較多，僅在我國登記的就有嘧菌酯、代森鋅、苯醚甲環唑、福美雙、苯菌靈等10 種殺菌劑和1 種誘導抗病激活劑氨基寡糖素（中國農藥信息網，http：//www.chinapesticide.org.cn/fwb/index.jhtml），也有報道表明吡唑醚菌酯、醚菌酯等殺菌劑（董克鋒 等，2015；劉美玲 等，2019；宋化穩 等，2019）和春雷霉素、多抗霉素等抗生素（楊迎春等，2018；楊帥 等，2021）對蘆筍莖枯病也有較好的防治效果。為篩選出更多對蘆筍莖枯病具有較好防治效果的殺菌劑，本試驗選取了部分與已經登記防治該病害的藥劑具有相同作用機理的殺菌劑，如代森鋅與丙森鋅，均屬于二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑；嘧菌酯與醚菌酯、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯均為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其中吡唑醚菌酯和啶氧菌酯均為甲氧基丙烯酸酯類較新的殺菌劑，且活性較高。本試驗對11 種藥劑進行了生物活性測定，結果發現吡唑醚菌酯可以完全抑制蘆筍莖枯病菌菌絲的生長；之后在對5 種殺菌劑防治蘆筍莖枯病的盆栽試驗效果評價時也發現，吡唑醚菌酯表現最佳，防效可達到94.56%，該殺菌劑在我國登記可用于防治蘆筍褐斑病（Sacc.）（中國農藥信息網）。因此，在蘆筍發生莖枯病或者褐斑病時選用吡唑醚菌酯進行防治，具有兼防（預防）兩種病害的作用，提高了殺菌劑的使用效率，降低了用藥量，具有節本增效的意義。

為降低田間頻繁用藥可能導致的抗藥性問題，增加交替用藥的選擇范圍。本試驗在生物活性測定中選擇了具有不同作用機理的殺菌劑，如二甲酰亞胺類觸殺性、保護性殺菌劑異菌脲和腐霉利，應用范圍和殺菌譜較廣的琥珀酸脫氫酶抑制劑氟吡菌酰胺，以及廣譜、保護性殺菌劑百菌清，測定結果發現異菌脲和百菌清對蘆筍莖枯病病原菌均表現較好的生物活性，EC值分別為2.25 μg·mL和0.13 μg·mL，可作為田間防治蘆筍莖枯病的替換用藥。

本試驗同時發現，在我國登記用于防治蘆筍莖枯病的殺菌劑嘧菌酯的生物活性較差，其EC值高達48.70 μg·mL。嘧菌酯在杭州市佳慧蘆筍種植基地屬于防治蘆筍莖枯病的常用藥劑，推測可能是由于該藥劑在田間應用頻繁，導致當地蘆筍莖枯病病原菌菌株存在一定程度的抗藥性，因此活性降低。生產中建議合理用藥，多種作用機理殺菌劑輪換使用以減少抗藥性發生。

盆栽藥效評價試驗中，選擇先施藥后接種的預防用藥措施，篩選出了對莖枯病防治效果較好的吡唑醚菌酯。建議在田間蘆筍莖枯病易發病季節，提前選擇吡唑醚菌酯進行1～2 次預防用藥，不但可以預防莖枯病的發生，也可以兼防褐斑病。但由于吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，國際殺菌劑抗性行動委員會將該類殺菌劑定義為高風險抗藥性類別（FRAC，2021），應用時需要與其他殺菌劑輪換使用，且單個生長季節不要超過3 次用藥。同時也需要重視新型殺菌劑的開發和應用（王建國 等，2002），為更好地防控蘆筍莖枯病提供資源儲備。