電針干預對帕金森病模型小鼠黑質中酪氨酸羥化酶及氧化應激因子表達的影響

趙穎倩,亢愷雯,劉奇,馬雪,李杰,魯剛,王強,3,4

[1.陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,咸陽 712046;3.陜西省針藥結合重點實驗室,咸陽 712046;4.咸陽市神經生物學(針灸)重點實驗室,咸陽 712046]

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的神經系統(tǒng)退行性疾病[1]。PD多好發(fā)于中老年人,臨床常根據患者運動體征的改變如靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵硬和體態(tài)不穩(wěn)來診斷及針對治療。其主要病理學特點為中腦黑質致密部多巴胺能神經元選擇性變性及缺失,殘存神經元中出現以α-突觸核蛋白為主要成分的路易小體[2],導致紋狀體多巴胺耗竭,丘腦功能增強以及皮質運動區(qū)的興奮性傳入減少,從而使患者出現運動功能障礙。PD的發(fā)病與遺傳、環(huán)境、免疫、氧化應激等多種因素綜合作用有關,氧化應激在其中起著至關重要的作用[3],但其具體的發(fā)病機制尚未明確[4]。PD在世界范圍內影響著近500萬人的身體健康,預計2040年全球PD患者人數將增加4倍[5]。因此,尋找PD相關致病因素,為治療及預防提供新的策略和靶點已經迫在眉睫。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)小鼠模型是目前應用最廣泛的 PD模型,研究已證實MPTP小鼠模型在癥狀及病理學方面均符合臨床PD的特征,是一種較理想的PD模型[6]。

本實驗擬通過MPTP皮下緩釋構建小鼠PD模型,觀察早期電針干預對PD模型小鼠運動障礙改善、小鼠腦黑質組織中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、氧化應激因子超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)-2和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, Gpx-1)蛋白表達的影響,證明“嗅三針”可以通過抑制 PD小鼠的氧化應激反應,達到改善PD模型小鼠運動功能障礙的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與方法

選取40只10周齡清潔級雄性昆明小鼠作為研究對象,體質量(18±5)g,實驗使用許可證號為SYXK(陜)2018-001。根據隨機數字表法隨機分為空白組、PD組、針刺組和左旋多巴組,每組10只。動物由西安交通大學實驗動物中心提供,生產許可證號為SCXK(陜)2020-001。環(huán)境溫度為 20～24 ℃,濕度為40%～70%,12 h明暗交替,適應性喂養(yǎng)1周。對動物的處理遵循《關于善待實驗動物的指導意見》[7]。

1.2 主要試劑與儀器

山羊抗鼠SOD2抗體(ab118340,英國Abcam);山羊抗小鼠Gpx-1抗體(PAB7049, Abnova);山羊抗小鼠TH抗體(ab75875, Abcam);山羊抗兔IgG H&L(HRP)抗體(ab3816,英國 Abcam);抗生物素蛋白生物素化辣根過氧化物酶復合物(ZY131095,澤葉生物);小鼠 TH免疫組化試劑盒(ab137869,英國 Abcam);Braford蛋白濃度測定盒(批號 V900144, biosharp);SDS-PAGE凝膠制備盒(批號V900483, biosharp);左旋多巴(72816,美國SIGMA);MPTP(M0896,美國Sigma)。高速冷凍離心機(美國貝克曼);組織切片機(德國萊卡);SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);酶標儀(美國 Bio-Rad);Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics);蛋白電泳轉膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.3 模型制備

PD模型[8]采用清潔級成年昆明小鼠,吸入式麻醉機麻醉小鼠(異氟醚溶液誘導濃度4%,維持濃度1.5%),手術過程中持續(xù)麻醉。小鼠后背部皮下0.5 cm左右做橫切口,鈍性分離皮膚與肌肉,手術植入注滿 MPTP溶液的膠囊滲透壓泵,向泵內注射 200 μL的 MPTP溶液,MPTP含量為0.5 mg,緩釋速度7 μL/d,總時長4周;空白組小鼠予以同樣處理,泵內注射200 μL生理鹽水溶液[9]。小鼠出現震顫、立毛、倦怠及運動測試障礙證明造模成功[10]。

1.4 干預方法

1.4.1 空白組

僅同步抓取,無其他干預。

1.4.2 PD組

僅植入注滿MPTP膠囊滲透壓泵,之后不進行任何干預。

1.4.3 針刺組

于造模2周后開始采用針刺干預。參照《實驗針灸學》[11]進行穴位定位,取神庭和雙側天樞、上巨虛穴。神庭位于前正中線,額頂骨縫交界線前方;上巨虛穴位于小鼠脛骨外側,偏下方6 mm,直刺3～4 mm;天樞穴位于小鼠前正中線旁開5 mm,恥骨聯合以上20 mm,直刺2～3 mm。正極接天樞穴,負極分別接神庭穴10 min,上巨虛穴10 min,刺激參數為疏密波,頻率為2～15 Hz,強度為 1 mA,以小鼠肢體輕微震顫為度。每日干預20 min,1個療程為5 d,后休息2 d,共治療6個療程。

1.4.4 左旋多巴組

應用西藥左旋多巴,以每日3 mg/kg的劑量,對PD模型小鼠于造模2周后進行灌胃。每日1次,治療5 d為1個療程,休息2 d,共治療6個療程。

1.5 指標檢測

1.5.1 行為學檢測

電針干預6個療程結束后第1天進行行為學檢測,包括步長實驗和游泳實驗。步長實驗具體為,設置泡沫板通道,在通道的底部固定等尺寸的膠水白紙,在實驗前對全部的小鼠進行適當的訓練,確定出步長,將小鼠后趾使用墨汁染黑后等待其穿過通道,最后測算同側腳印間距的平均值[12]。游泳實驗具體為,小鼠禁食 12 h后稱重,在小鼠尾部懸吊約為其體質量10%的保險絲,后將小鼠放入水箱,自投入水內開始,用秒表計算鼻孔下沉水面所需時間,水溫27 ℃左右,測定其游泳時間。行為學測試結束后進行心臟灌注取材[13]。

1.5.2 免疫組化法檢測黑質區(qū)TH表達

用4%的水合氯醛溶液(每10 g體質量注射0.1 mL)腹腔注射麻醉,麻醉小鼠后,用生理鹽水和 4%多聚甲醛溶液經左心室快速灌注固定腦組織,根據小鼠腦立體定位圖譜,切除前囟后,于 3～4 mm的冠狀切面,采用腦模具截取黑質部分。制作切片后BSA封閉,一抗孵育 4 ℃過夜后 PBS沖洗,滴加二抗孵育,PBS沖洗后DAB溶液顯色并觀察。200倍視野下,每張切片選取3～4個視野,Image Pro-Plus分析并計算TH陽性細胞數,陽性細胞為細胞漿染成棕褐色。

1.5.3 Western blot法檢測黑質區(qū) TH、SOD-2和Gpx-1蛋白表達

小鼠腦黑質組織中加入 RIPA裂解液進行冰上研磨、裂解、離心(15 min)后,然后用考馬斯藍法測定蛋白濃度,繼而進行SDS-PAGE電泳,轉膜后用5%脫脂奶粉封閉液孵育1 h。于4 ℃冰箱分別置于TH、SOD-2、Gpx-1和GAPDH(均為1:5 000)一抗中孵育過夜、洗膜后,使用相應二抗(1:2 000)避光室溫孵育1 h后洗膜后,發(fā)光顯影。結果用Bandscan5.0軟件進行掃描,分析TH、SOD-2、Gpx-1及內參GAPDH的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法

所以數據采用 SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組造模后行為學測試結果比較

與空白組比較,PD組小鼠步長距離減少,游泳時間縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與PD組比較,針刺組小鼠的步長距離顯著加長,游泳時間有顯著延長,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與PD組比較,左旋多巴組小鼠的步長和游泳時間也有顯著提高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 4組造模后行為學測試結果比較 (±s)

表1 4組造模后行為學測試結果比較 (±s)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與PD組比較2)P＜0.05

組別 n 步長距離(cm) 游泳時間(min)空白組 10 8.89±1.12 4.85±0.99 PD組 10 4.23±1.381) 1.81±1.081)針刺組 10 6.51±1.012) 3.14±1.212)左旋多巴組 10 7.32±1.222) 3.26±1.512)

2.2 4組小鼠中腦黑質中SOD-2、Gpx-1表達比較

與空白組比較,PD組小鼠黑質中SOD-2和Gpx-1的蛋白表達量顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與PD組比較,針刺組黑質中SOD-2和Gpx-1表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與PD組比較,左旋多巴組的SOD-2和Gpx-1表達也顯著提高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見圖1、圖2。

圖1 4組小鼠黑質SOD-2蛋白的表達及條帶圖

圖2 4組小鼠黑質Gpx-1蛋白的表達及條帶圖

2.3 4組小鼠中腦黑質中TH表達比較

與空白組比較,PD組小鼠黑質中TH蛋白表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與 PD組比較,針刺組黑質中 TH表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與PD組比較,左旋多巴組TH表達無顯著性變化(P＞0.05),詳見圖3、圖4。

圖3 4組小鼠黑質中TH蛋白免疫組化結果(×200倍)

圖4 4組小鼠黑質中TH蛋白表達及條帶圖

3 討論

隨著我國進入人口老齡化階段,老年病之一的帕金森病(PD)患者人群數量逐漸龐大,目前臨床主要采用多巴胺類藥物進行治療,但長期使用所致的副作用使患者備受困擾,所以探求發(fā)病原因以及尋找新的治療方式逐漸成為重要的研究方向。PD的主要病理改變?yōu)槎喟桶?dopamine, DA)能神經元變性、丟失及路易小體(lewy body, LB)的形成,氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥及機體免疫反應參與其中。鈣超載、多巴胺代謝失衡、谷胱甘肽等還原劑水平降低等諸多因素均會導致體內的氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡[14]。氧化反應過程中線粒體中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(glutathione, rglutamyl cysteingl glycine, GSH)可催化活性氧生成二價氧和水,避免細胞損傷[15]。在許多PD病例中,氧化應激被認為是導致細胞功能障礙和死亡的潛在機制[16]。PD患者尸檢結果表明,其黑質內8-羥基鳥苷、蛋白質羰基等氧化標志物顯著高于其他腦區(qū),表明黑質細胞遭受氧化應激損傷[17]。在帕金森病中,線粒體功能障礙可能提高發(fā)病率,黑質 DA神經元更容易發(fā)生氧化應激反應,繼而導致線粒體 DNA突變幾率增高,最終會形成不斷的惡性循環(huán),導致帕金森病病情加重[18]。本次實驗的結果表明,針刺組與PD組相比,針刺組黑質中SOD-2和Gpx-1表達升高,針刺組小鼠的抗氧化能力顯著升高,這為其治療帕金森病提供理論依據。

氧化應激也促進致病蛋白質的聚集,干擾細胞自噬,導致年齡和疾病相關蛋白酶體功能障礙[19]。在線粒體基因組突變、氧化應激,毒素刺激等因素下,線粒體產生功能失調,這是PD發(fā)病關鍵環(huán)節(jié)。經典PD模型制備,正是抑制了線粒體復合體Ⅰ功能導致神經元損傷[20]。線粒體復合體Ⅰ被抑制后,不僅影響ATP生成,也導致活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)生成增加,損傷mtRNA, ATP合成不足也會導致門冬氨酸及谷氨酸等興奮性遞質增加,對神經元產生毒性[21]。Aβ寡聚體也可干擾線粒體與內質網的鈣離子交換,抑制受損線粒體自噬[22-23]。隨著機體的衰老,氧化應激及細胞凋亡增加,產生大量ROS,線粒體DNA損傷加劇,因此年齡是影響PD發(fā)病最大風險因素[24]。

黑質中的酪氨酸羥化酶(TH)表達近年來被認為與PD發(fā)病具有相關性,有報道針灸療法可以提高腦黑質TH的表達[25],本次實驗結果表明,MPTP誘導的PD模型小鼠TH含量減少,針刺干預可以提高TH的表達,推測可能是通過增加 TH的表達而提高了多巴胺的合成能力,進而達到改善模型小鼠運動能力的目的。

1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenyl pyridinium, MPP+)是MPTP的活性代謝產物,有研究證明,它同 MPTP一樣,對多巴胺能神經元具有損傷作用[26],其不僅會促使 DA異常釋放,還會導致細胞一系列的氧化應激反應[27]。近來MPTP與膠質細胞活化以及DA神經元損傷之間的關系也引起了廣泛的關注[28],其次通過神經行為學實驗評價,證明MPTP誘導完全可以模擬PD患者的運動障礙[29]。本實驗采用緩釋模型,總時長4周,與腹腔注射急性模型比較,慢性模型更好地模擬了PD的病理學特征[30]。本實驗選用游泳實驗及步長實驗,分別從步態(tài)及運動耐性兩個角度評價其運動功能。針刺組小鼠的步長距離、游泳時間與PD組比較顯著加長,針刺干預改善小鼠PD典型運動癥狀。

PD屬于中醫(yī)學“顫證”“震顫”“痙證”的范疇,早在《素問·至真要大論》中就諸如“諸風掉眩,皆屬于肝”“諸痙項強,皆屬于濕”等記載[31]?；凇澳X病治腸”理論,在前期研究中發(fā)現針刺由、神庭和雙側天樞、上巨虛五穴對PD及其以早期便秘為主的非運動癥狀均有較好的改善作用[32]。其中神庭為督脈穴,為與足陽明胃經之交會穴,“病變在腦,首取督脈”,其功效是開竅通絡止顫;足陽明胃經穴位上巨虛是大腸的下合穴,“邪在腑,取之合”[33],“合治內腑”,具有調節(jié)胃腸功能的作用。天樞穴為大腸募穴,是人體上下氣機交匯之處,升清降濁之樞紐,能夠通大腸和通肺氣,配合上巨虛共同發(fā)揮調節(jié)胃腸功能作用。以上諸穴合用,“上下同調”可開竅、止顫,通調氣機、合胃通腑[34-35]。本實驗結果顯示,早期電針干預可抑制 PD小鼠氧化因子表達,增強機體抗氧化作用,緩解 PD運動功能障礙,為治療PD提供了新的治療靶向。