短波紫外發光二極管處理對脂環酸芽孢桿菌的滅活效果及作用機制

翟婭菲，田佳麗，石佳佳，相啟森，申瑞玲，王章存，李 可

（鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001）

近年來，中國的果汁飲料市場發展快速，果汁飲料中豐富的維生素和生物活性化合物以及優良的口感成為其吸引消費者的主要原因[1]。但由脂環酸芽孢桿菌引起的果汁變質在美國、澳大利亞等國相繼發生[2]。脂環酸芽孢桿菌是一種嗜酸、嗜熱、非致病性的革蘭氏陽性菌，能夠通過產生孢子來度過不利于營養細胞生長的時期，傳統的巴氏殺菌不能夠使其完全滅活[3]。尋找合適的殺菌方式以有效滅活脂環酸芽孢桿菌一直在不斷的探索中。

非熱殺菌技術由于其殺菌過程中的低溫特性，可以避免溫度對食品造成的不良影響，不僅能有效滅活微生物，而且能較大程度地保留食品固有的特質[4-5]；因此，近年來在食品殺菌中備受關注。de Pascoli等[6]發現盾葉胡椒提取物可作為抑菌劑有效減少橙汁中初始脂環酸芽孢桿菌的數量。Porebska等[7]的研究表明，基于超高壓和溫熱（50 ℃）聯合處理的協同效應對蘋果汁進行殺菌后，蘋果汁中脂環酸芽孢桿菌孢子數量降低了3.7（lg（CFU/mL））。近年來出現的紫外殺菌技術也被認為在食品工業中具有廣闊的應用潛力。2000年，紫外光已被美國食品藥品監督管理局批準作為巴氏殺菌的替代方法來處理新鮮果汁產品[8]。此外，紫外光已被印度和瑞士等一些國家批準應用于食品加工過程[9]。紫外發光二極管照射是近年來新興的一種非熱殺菌技術，與傳統的紫外汞燈相比具有可及時開關，無熱輻射、無汞、體積小、壽命長以及可發射特定波長的光的優點，因此，在食品工業中具有更明顯的應用潛力[10]。紫外發光二極管已經被應用于多種食品上多種微生物的滅活。使用波長為280 nm、照射劑量為720 mJ/cm2的短波紫外發光二極管（ultraviolet-C lightemitting diode，UVC-LED）分別處理蘋果濁汁和蘋果清汁，可使其中的Escherichia coliK12數量分別減少2、4.4（lg（CFU/mL））[11]。將波長為275 nm的UVC-LED應用于蘋果汁和金槍魚的微生物安全控制中，當照射劑量達到1 200 mJ/cm2時可使蘋果汁中的魯氏結合酵母降低5.64（lg（CFU/mL）），當照射劑量達到4 000 mJ/cm2時，可使金槍魚表面的SalmonellaTyphimurium、Listeria monocytogenes以及Escherichia coliO157:H7數量分別減少1.31、1.86、1.77（lg（CFU/mL）），并且對蘋果汁和金槍魚的理化性質無明顯影響[12-13]。

本課題組先前研究發現1 080 mJ/cm2UVC-LED（275 nm）處理可以有效滅活接種在橙汁中的脂環酸芽孢桿菌[14]，因此，本研究以純培養體系中的脂環酸芽孢桿菌為研究對象，評價照射劑量對滅活效果的影響，以及相同照射劑量對處于不同生長階段脂環酸芽孢桿菌的滅活作用，并通過分析蛋白、核酸的泄漏量，細胞膜的完整性，胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）累積水平以及處理后胞內蛋白質、DNA的損傷情況來探討脂環酸芽孢桿菌的滅活機理，以期為UVC-LED在食品工業中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂環酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）DSM 3922 廣東省微生物菌種保藏中心；BAT肉湯北京索萊寶科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、吖啶橙（acridine orange，AO） 生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UVC-LED設備（波長275 nm）由本實驗室自制；NI-E熒光相差自動顯微鏡 日本尼康公司；UV-1500紫外分光光度計 上海美析儀器有限公司；Spark多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo?Fisher?Scientific公司；BWS465-785S便攜式拉曼光譜儀 美國B&W公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將甘油管保存的脂環酸芽孢桿菌按照1%（體積分數）的接種量接種至50 mL BAT肉湯中，在45 ℃下搖床振蕩培養（180 r/min，下同）29 h，取培養物于3 500hg下離心10 min，收集菌體。加入10 mL無菌生理鹽水重懸菌體，3 500hg離心10 min后收集菌體，按此方法清洗3 遍，然后用無菌生理鹽水將菌懸液濃度調整為106CFU/mL備用。

1.3.2 UVC-LED處理脂環酸芽孢桿菌

UVC-LED設備如圖1所示，發射峰值為275 nm的UVC-LED燈以8 行8 列的形式排布在22 cmh22 cm的集成板上。UVC-LED照射劑量為照射功率/（mW/cm2）和處理時間/s的乘積[13]，單位為mJ/cm2。由于照射功率（450 mW/cm2）固定不變，通過改變處理時間來控制照射劑量。

圖1 UVC-LED處理脂環酸芽孢桿菌示意圖Fig. 1 Schematic diagram of UVC-LED treatment of A. acidoterrestris

將盛有20 mL菌懸液（106CFU/mL）的培養皿用不同劑量（0（未處理組）、10、20、30、40、50 mJ/cm2）UVC-LED進行照射處理，處理后的菌液用生理鹽水進行梯度稀釋（10、102、103、104），以未處理組為對照，選取100 μL各梯度的菌液均勻涂布于BAT固體培養基上，每個梯度設置3 個平行，45 ℃培養48 h進行菌落計數，每組實驗重復3 次。

1.3.3 存活曲線的模擬

利用log-linear和Weibull模型對細菌的存活曲線進行動力學模擬[14]，log-liner模型見公式（1），Weibull模型見公式（2）。

式中：N為一定劑量UVC-LED處理后存活的細菌數量/（CFU/mL）；N0為處理前樣品中細菌數量/（CFU/mL）；E為處理劑量/（mJ/cm2）；k為失活系數；D為微生物數量減少90%所需的處理劑量（mJ/cm2）；δ代表微生物數量減少90%所需的處理劑量/（mJ/cm2）；p為形狀參數。

1.3.4 UVC-LED對處于不同生長階段的脂環酸芽孢桿菌的滅活作用測定

參照文獻[15]，將1.5 mL處于對數生長期的脂環酸芽孢桿菌培養液接種于50 mL BAT肉湯中，45 ℃下搖床振蕩培養24 h，按照6%（體積分數）的接種量添加至300 mL新鮮BAT肉湯中，于45 ℃下搖床振蕩培養。脂環酸芽孢桿菌在生長過程中會經歷一段時間的遲緩期，逐漸進入對數期，最終達到穩定期。因此在2、4、8、12、16、24、29、32、36、39 h測定菌液600 nm波長處光密度值OD600nm；分別在2、4、24、29、32 h收集30 mL菌液，于3 500hg下離心10 min收集菌體，加入10 mL無菌生理鹽水3 500hg離心10 min后收集菌體，按此方法清洗3 遍，用生理鹽水將菌懸液濃度調整為105CFU/mL，取10 mL制備好的菌懸液于培養皿中，按照1.3.2節方法用20 mJ/cm2劑量的UVC-LED處理菌懸液并進行菌落計數，計算細菌的存活率（N/N0h100%）。

1.3.5 胞內核酸和蛋白質泄漏量的測定

分別取1 mL 1.3.2節不同劑量的UVC-LED處理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液。用NanoDrop 2000超微量分光光度計分別在260 nm和280 nm波長處測定上清液的光密度值，計算核酸和蛋白質的泄漏量，單位為μg/mL。

1.3.6 細胞膜損傷程度測定

分別取1 mL 1.3.2節不同劑量的UVC-LED處理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L、pH值為（7.2f0.2），后同）重懸菌體，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，清洗兩遍后重懸于800 μL的PBS中，加入200 μL PI染液（3?μmol/L），室溫下避光反應15 min，然后12 000 r/min離心2 min收集菌體。加入1 mL PBS重懸菌體，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，洗滌3 次以去除未反應的染液，最終將菌體懸于1 mL PBS中，在激發波長485 nm、發射波長635 nm條件下測定其熒光強度。細胞膜損傷程度以相對熒光強度表示，具體計算如公式（3）所示。

1.3.7 胞內ROS水平的測定

采用DCFH-DA熒光探針測定ROS水平。分別取1 mL 1.3.2節不同劑量處理后的菌液，于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入1 mL無菌PBS重懸菌體，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，清洗兩遍后重懸于800 μL PBS中，加入200 μL DCFH-DA染液（終濃度為10?μmol/L），37 ℃條件下避光反應30 min，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體。加入1 mL無菌PBS重懸菌體，4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，清洗兩遍后重懸于1 mL PBS中。在激發波長為480 nm、發射波長為530 nm的條件下測定熒光強度，ROS水平以相對熒光強度表示，計算同式（3）。

1.3.8 脂環酸芽孢桿菌可溶性蛋白的測定

取對數期脂環酸芽孢桿菌培養液，按照6%（體積分數）的接種量添加至300 mL BAT肉湯中，45 ℃、180 r/min條件下培養29 h，離心（3 500hg、10 min）收集菌體并用生理鹽水稀釋到106CFU/mL。按照1.3.2節方法采用不同劑量UVC-LED處理脂環酸芽孢桿菌，4 ℃、3 500hg下離心10 min，收集菌體后再重懸于10 mL生理鹽水中，400 W超聲破壁10 min，每超聲處理5 s間歇5 s。超聲處理后6 000hg離心15 min，收集上清液即為細菌的可溶性蛋白溶液。采用便攜式拉曼光譜分析細菌可溶性蛋白結構的差異，激發波長為785 nm，功率為80 mW，曝光時間為60 s，掃描次數為4 次，掃描范圍400～2 000 cm－1。

1.3.9 胞內DNA損傷情況的觀察

分別取1 mL 1.3.2節經0、30、50 mJ/cm2劑量UVC-LED處理后的菌液，離心（4 ℃、12 000 r/min，5 min）收集菌體，然后加入1 mL PBS于4 ℃、12 000 r/min離心2 min清洗菌體，重復清洗兩遍后將菌體重懸于500?μL?PBS中，加入500?μL?AO染液（終質量濃度為0.1 mg/L），室溫避光反應10 min，12 000 r/min離心2 min收集菌體，按上述條件（4 ℃、12 000 r/min離心2 min）用PBS清洗3 次去除未反應的染液，然后將菌體懸于200?μL?PBS中，立即在熒光相差自動顯微鏡（40 倍物鏡）下觀察。

1.4 數據處理與分析

實驗設置3 個平行，實驗結果以平均值±標準差表示，數據均采用Excel軟件進行處理，采用GraphPad Prism 9.0.0軟件繪制柱狀圖，采用Origin 2018軟件繪制曲線圖。通過SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan多重比較進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 UVC-LED劑量對脂環酸芽孢桿菌的滅活效果

脂環酸芽孢桿菌的初始菌落數為6.0（lg（CFU/mL）），隨著UVC-LED照射劑量的增加，脂環酸芽孢桿菌的存活數量逐漸減少（圖2）。當照射劑量達到50 mJ/cm2時，可使存活的細菌數量降低4.6（lg（CFU/mL）），與Murashita等[16]研究結果相似，證明UVC-LED能夠有效滅活細菌，劑量越大滅活效果越強。有研究表明，用UVC-LED處理冰中的SalmonellaTyphimurium、Listeria monocytogenes、Escherichia coliO157:H7，當紫外劑量達到40 mJ/cm2時可將Listeria monocytogenes完全滅活，而劑量增加到100 mJ/cm2時，SalmonellaTyphimurium和Escherichia coliO157:H7仍有存活[16]。由此可知，細菌類型會影響殺菌效果，微生物的生理狀態包括細胞壁的厚度、細胞的大小、照射產生的光生成物以及DNA修復能力都會影響細胞對UVC-LED的敏感程度，進而造成滅活效果的差異[17-18]。

圖2 UVC-LED處理下脂環酸芽孢桿菌的存活曲線Fig. 2 Survival curve of A. acidoterrestris treated by UVC-LED

存活曲線的模擬結果如表1所示，UVC-LED對生理鹽水中脂環酸芽孢桿菌的殺滅作用既符合log-linear模型又符合Weibull模型，兩個模型的R2均大于0.990 0。UVC-LED對橙汁中脂環酸芽孢桿菌的殺滅作用更符合Weibull模型[14]，且使細菌總量減少90%所需的照射劑量（39.36 mJ/cm2）也遠大于生理鹽水中所需的照射劑量（9.79、10.26 mJ/cm2），可能的原因為細菌所在基質的組成和理化特性對UVC-LED的殺菌存在影響[19]。因此，UVC-LED對不同基質中細菌的殺菌效果不同，還需更深入的具體研究。

表1 生理鹽水中脂環酸芽孢桿菌經UVC-LED處理后的存活曲線模型及相關參數Table 1 Evaluation of survival curve models of A. acidoterrestris in saline solution after UVC-LED treatment

2.2 UVC-LED對不同生長階段脂環酸芽孢桿菌的滅活作用

由圖3可知，脂環酸芽孢桿菌在0～6 h間處于遲緩期，7～30 h為對數生長期，之后進入穩定期。由圖3和表2可知，用相同劑量的UVC-LED處理不同生長時期的細菌，處于遲緩期和剛進入穩定期的菌體對UVC-LED處理的耐受性最強，存活率較高；而處于對數期的菌體對UVC-LED比較敏感，存活率相對較低，此時殺菌效果最好。錢靜亞[20]在對枯草芽孢桿菌進行脈沖磁場處理時也發現，微生物處于不同生長階段時對脈沖磁場處理的敏感性不同，處于對數期的枯草芽孢桿菌殘留率較低。分析認為，處在不同生長階段的脂環酸芽孢桿菌對于UVC-LED敏感程度不同，這與細菌自身的狀態有直接的關系，細胞的生長與自身對環境的適應性密切相關。處于遲緩期的細菌，由于環境的突然改變使其基本呈現不生長的狀態；適應環境之后細菌進入對數期，迅速繁殖生長；一段時間之后，由于環境中營養物質消耗以及代謝產物累積再次限制了細菌的生長，進入穩定期。一般當面對外部壓力時，例如環境的改變，細菌會通過表達相關基因并降低細胞膜的流動性等方式進行損傷修復、保護或適應。這可能是遲緩期和剛進入穩定期時菌體對UVC-LED抵抗性增強的原因[15]。

圖3 脂環酸芽孢桿菌的生長曲線Fig. 3 Growth curve of A. acidoterrestris

表2 不同生長時期脂環酸芽孢桿菌經相同劑量UVC-LED處理后存活率Table 2 Survival rates of A. acidoterrestris treated with the same dose of UVC-LED at different growth stages

2.3 UVC-LED處理對脂環酸芽孢桿菌胞內核酸和蛋白質泄漏量的影響

通過測定UVC-LED照射處理后胞內核酸和蛋白質的泄漏情況來評估脂環酸芽孢桿菌細胞膜通透性的變化。如圖4所示，隨著UVC-LED照射劑量的增加，細菌胞內核酸和蛋白質泄漏量呈顯著增加趨勢。由此說明，UVC-LED處理可以改變細胞膜的通透性，造成胞內核酸、蛋白質的泄漏。王哲[21]在對大腸桿菌進行UVC-LED處理時也有類似發現，短時間的照射破壞了大腸桿菌細胞膜以及細胞壁，造成核酸泄漏，OD260nm略有增加；同時在對處理3 min和5 min的大腸桿菌進行掃描電子顯微鏡觀察中發現，細菌表面略有變形，但變化程度不大。細胞膜以及細胞壁的破損會導致內容物的流出，影響細胞活性，但是整體變化趨勢較小，因此內容物的泄漏不足以成為UVC-LED致死細菌的主要原因。

圖4 UVC-LED處理后脂環酸芽孢桿菌胞內核酸（A）和蛋白質（B）的泄漏量Fig. 4 Amounts of nucleic acid (A) and protein (B) leaked out of A. acidoterrestris cells after UVC-LED treatments

2.4 UVC-LED處理對脂環酸芽孢桿菌細胞膜的影響

PI具有不透膜性，對于未受損的細胞而言，PI不能夠正常進入胞內，當細胞膜遭到破壞，PI進入胞內并與核酸結合在熒光下顯現紅色。因此，可通過測定UVC-LED照射后細胞內PI的相對熒光強度評估細胞膜的完整性。圖5反映了不同照射劑量處理后脂環酸芽孢桿菌胞內PI的累積情況，照射后細胞的PI相對熒光強度顯著高于未處理的細胞，不同劑量的處理對PI的相對熒光強度影響不顯著。結果表明，照射處理對細胞膜完整性有一定程度的影響。據報道，波長不高于275 nm的紫外光能夠破壞C－H鍵和C－C鍵[22]，因此，275 nm波長的紫外光處理能夠損傷膜蛋白，從而破壞膜的完整性[23]。

圖5 不同劑量UVC-LED處理后胞內PI相對熒光強度Fig. 5 Effect of UVC-LED treatments on relative fluorescence intensity of intracellular propidium iodide

2.5 UVC-LED處理對脂環酸芽孢桿菌胞內ROS水平的影響

如圖6所示，脂環酸芽孢桿菌經低劑量的UVC-LED照射后，胞內ROS水平沒有明顯變化，當劑量提高到40、50 mJ/cm2時，其胞內ROS的水平略有提高，但與處理組仍不存在顯著性差異（P＞0.05）。這些結果表明，UVC-LED照射處理沒有造成細菌胞內ROS的累積，胞內的ROS不是造成細菌死亡的主要原因。Song Kai等[24]在用UVC輻照大腸桿菌的研究中加入相應的ROS清除劑，未觀察到大腸桿菌死亡率的改變，說明UVC對大腸桿菌的滅活不涉及超氧自由基、羥自由基和過氧化氫等ROS的參與。研究表明，UVA主要被發色團的分子吸收，可產生氧化中間物如ROS，繼而破壞蛋白、DNA以及細胞膜等，從而造成細菌死亡[25]，而UVC導致的細菌失活與ROS沒有直接的關系。

圖6 不同劑量UVC-LED處理對ROS水平的影響Fig. 6 Effect of UVC-LED treatment on ROS levels

2.6 UVC-LED處理對脂環酸芽孢桿菌可溶性蛋白的影響

經不同劑量UVC-LED處理后，細菌可溶性蛋白結構的差異可通過拉曼光譜反映，拉曼位移和強度的改變反映了蛋白二級結構及微環境的改變。未處理和經不同劑量UVC-LED處理后的菌體可溶性蛋白在400～2 000 cm－1范圍內的拉曼吸收強度如圖7所示。經UVC-LED處理后細菌可溶性蛋白的拉曼光譜存在差異。1 665 cm－1附近的酰胺I帶和位于1 250 cm－1的酰胺III帶能夠間接反映蛋白質主鏈的結構，涉及蛋白質的二級結構包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規卷曲[26]。根據實驗所得拉曼光譜圖看出，經處理后兩個譜帶的吸收峰值發生一定變化。表明紫外光破壞了蛋白質分子結構，從而改變二級結構包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規卷曲的含量。譜線中特征峰大部分屬于氨基酸譜線，呈現不規則的波動。側鏈氨基酸的改變主要是微環境的變化引起的。經照射處理后的譜線在830 cm－1和850 cm－1附近酪氨酸殘基的特征雙峰中的峰值均高于未處理組，這可能是由于UVC-LED處理改變了菌體可溶性蛋白存在的微環境，使酪氨酸逐漸暴露。位于760 cm－1處色氨酸的峰值變化可以反映檢測微環境的極性，有研究發現，色氨酸殘基從疏水的環境中暴露于極性溶劑中，拉曼位移在760 cm－1處的強度會發生下降。圖7譜線中經UVC-LED處理后760 cm－1處強度有所增加，表明在疏水環境中的色氨酸殘基被進一步包埋，紫外照射使得微環境向非極性轉變。1 450 cm－1附近脂肪族氨基酸峰值也有所提高，這歸因于照射處理破壞了原來的聚集體，更多更小的聚集體的形成增加了疏水基團暴露[27-29]。整體而言，UVC-LED處理后菌體可溶性蛋白的拉曼強度發生波動，由于部分蛋白在280 nm波長處有吸收峰[21]，處理過程中菌體的蛋白結構吸收紫外光后發生不同程度的降解和重組，同時UVC-LED處理對菌體中蛋白所處的微環境產生了影響。

圖7 UVC-LED處理后脂環酸芽孢桿菌可溶性蛋白拉曼光譜圖Fig. 7 Raman spectra of soluble proteins of A. acidoterrestris treated with UVC-LED

2.7 UVC-LED處理對脂環酸芽孢桿菌的DNA損傷情況

AO能夠透過細胞膜進入細胞并與DNA或RNA結合，在特定條件下呈現綠色或桔色熒光。未處理組中，細菌懸浮于生理鹽水中處于靜止期，與高效繁殖的細菌相比基本處于不活動的生理狀態，此時核酸主要以DNA雙鏈為主，AO與DNA雙鏈結合后熒光顏色以綠色為主（圖8）；UVC-LED處理組中，由于處理劑量的不同，熒光顏色呈現不同程度的橙色，經50 mJ/cm2的劑量處理之后，細菌呈現的熒光顏色以橙色為主。這說明UVC-LED處理造成了脂環酸芽孢桿菌DNA雙鏈的斷裂、變性及單鏈的產生，處理劑量越大，DNA雙鏈的損傷程度越大[30]。分析認為，細胞內DNA由于其堿基能夠直接吸收UVC而成為輻射的直接目標，導致DNA分子受到損傷。紫外處理過程中能夠形成有毒物質（如環丁烷嘧啶二聚體、（6-4）光產物及其杜瓦價鍵異構體）、致突變性DNA損傷甚至造成DNA鏈斷裂，如果不修復這種紫外線引起的損傷，最終會發生突變和細胞死亡[20,31-32]。UVC-LED處理脂環酸芽孢桿菌造成的DNA直接損傷程度較高，可能是引起細胞死亡的主要原因。

圖8 不同劑量UVC-LED處理脂環酸芽孢桿菌AO染色后的熒光顯微鏡圖像（×400）Fig. 8 Fluorescence microscopic images of AO stained A. acidoterrestris treated with different doses of UVC-LED (× 400)

3 結 論

研究證明UVC-LED能夠有效滅活脂環酸芽孢桿菌，特別是處于對數生長期的細菌對UVC-LED處理更加敏感。UVC-LED處理增大了細胞膜通透性，導致胞內核酸和蛋白質出現一定程度的泄漏，胞內蛋白的結構有所改變，而與未處理組相比胞內ROS水平沒有顯著變化（P＞0.05）。AO染色后熒光分析結果表明UVC-LED對DNA雙鏈結構產生影響，從而破壞微生物的生理功能，導致死亡。綜上，UVC-LED主要通過損傷DNA來滅活脂環酸芽孢桿菌，本研究可為UVC-LED的應用提供理論參考。