陳皮藥材HPLC特征圖譜的建立

劉根才 華杰

【摘 要】 目的：建立陳皮藥材HPLC特征圖譜，提高其質量控制水平。方法：采用HPLC法測定，Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為乙腈—0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為283 nm;以橙皮苷為參照物，運用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對測定的17批陳皮藥材數據進行處理分析。結果：建立了以8個特征峰為指標成分的陳皮藥材HPLC特征圖譜，以橙皮苷色譜峰為參照，其他7個特征峰的相對保留時間分別為0.486±0.049、0.898±0.090、1.380±0.138、1.874±0.187、1.996±0.200、2.153±0.215、2.287±0.229。結論：該方法經過方法學驗證，可用于陳皮藥材的質量控制。

【關鍵詞】 陳皮;橙皮苷;相對保留時間;HPLC;特征圖譜;質量控制

【中圖分類號】R284?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）17-0054-07

HPLC Specific Chromatograms of Citri Reticulatae Pericarpium

LIU Gencai HUA Jie*

Zhejiang Wecome Pharmaceutical Company Limited，Lishui 323000，China

Abstract：Objective To establish the specific chromatograms of Citri Reticulatae Pericarpium by HPLC，so as to improve its quality control.Methods The analysis was performed on Kromasil 100-5-C18 column（5μm，4.6 mm×250 mm） with a gradient mobile phase of acetonitrile—0.1% formic acid at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was set at 283 nm. Using phenylalanine as the reference solution，17 batches of samples of Citri Reticulatae Pericarpium were analyzed with the developed method， and similarity evaluation system for chromatographic finger print of traditional Chinese medicine（2012 Version）was used for the quality assessment.Results Eight common peaks were found through the similarity evaluation system. With phenylalanine as the reference， the relative retention time of the other seven peaks were 0.486±0.049，0.898±0.090，1.380±0.138，1.874±0.187，1.996±0.200，2.153±0.215，2.287±0.229，respectively.Conclusion The method has been validated by methodology， and can be used for the quality control of Citri Reticulatae Pericarpium.

Key words：Citri Reticulatae Pericarpium; Hesperidin; Relative Retention Rime; HPLC; Specific Chromatogram; Quality Control

陳皮為蕓香科植物橘Citri Reticulatae Pericarpium及其栽培變種的干燥成熟果皮，采摘成熟果實，剝取果皮，曬干或低溫干燥。陳皮具有理氣健脾，燥濕化痰的功效，用于脘腹脹滿，食少吐瀉，咳嗽痰多[1]。2020年版《中國藥典》陳皮藥材標準中控制的質量屬性有性狀、鑒別、檢查、含量測定等，未對初步確定的關鍵質量屬性水溶性浸出物及主要化學成分（指紋圖譜）進行控制。

中藥指紋圖譜是目前中藥產品質量控制主要手段之一，可更全面的反映中藥產品整體特征[2]。指紋圖譜研究常用高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法等[3]，陳皮主要化學成分為主要有黃酮類化合物、揮發油類、檸檬苦素類、生物堿類和微量元素等[4- 6]。其中黃酮類橙皮苷是陳皮中最主要活性成分之一，具有維持血壓正常滲透壓、降低血管脆性、降低人體膽固醇含量、抗過敏、降血壓、抑制癌變和抗病毒，抑菌，消炎，保肝等的作用[7-14]，其檢測方法主要為高效液相色譜法，檢測器為因紫外檢測器，紫外檢測器具有靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、有較好的選擇性，應用范圍廣，因此選擇高效液相色譜法紫外檢測器作為陳皮指紋圖譜方法開發的檢測器。

陳皮藥材可增加指紋圖譜方法進行專屬性鑒別，本試驗收集了不同產地的陳皮藥材，采用高效液相色譜法對其進行專屬性鑒別，建立了陳皮藥材HPLC指紋圖譜，為更好地控制陳皮藥材質量提供了可靠的方法依據。

1 儀器與材料

1.1 材料 橙皮苷對照品（批號：110721-201818，中國食品藥品檢定研究院）;川陳皮素對照品（批號：PS020082，成都普思生物科技股份有限公司）;桔皮素對照品（批號：PS010637，成都普思生物科技股份有限公司）;陳皮藥材（CP21060801，廣東省新會區;CP21060802，浙江省衢州區;CP21060803，四川省青白江區;CP21061101，浙江省開化縣;CP21061102，四川省金堂縣;CP21061103，河南省淅川縣;CP21061501，廣東省新會區;CP21061502，廣東省新會區;CP21061503，湖南省漢壽縣;CP21061504，湖南省漢壽縣;CP21061505，四川省高縣;CP21061506，四川省三臺縣;CP21061507，湖南省瀘溪縣;CP21062201，湖南省石門縣;CP21062202，湖南省中方縣;CP21062203，湖南省沅江市;CP21062204，浙江省衢州區），均購自浙江惠松制藥有限公司。乙腈[色譜純，批號：193478，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、甲酸（分析純，批號：1801089）、甲醇（分析純，批號：20190912）、乙醇（分析純，批號：20191011），均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Kromasil 100-5-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Kromasil），BK-900B超聲儀（濟南巴克超聲波儀器有限公司），MS205DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多），FA2004萬分之一電子天平（上海舜宇恒平儀器有限公司），LD610-2百分之一電子天平（沈陽龍騰電子科技有限公司），藥典檢驗篩（浙江上虞市華豐五金儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 陳皮粉末的制備 取陳皮藥材適量粉碎，過二號篩（24目），即得。

2.2 對照品溶液的制備 取橙皮苷、川陳皮素、桔皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為0.4 mg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粗粉（過二號篩），取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量;超聲處理30 min（功率900 W，頻率60 kHz），放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 色譜條件與系統適用性試驗 Kromasil 100-5-C18型色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B，按下表進行梯度洗脫;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL/min;檢測波長為283 nm。見表1。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取空白（甲醇）、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、陳皮藥材CP21061504，按“2.2”“2.3”項下方法制備對照品溶液和供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件進樣檢測分析。結果如圖1所示。

結果表明，空白溶劑未在供試品色譜相應位置出峰，供試品色譜中含有與橙皮苷、桔皮素、川陳皮素對照品保留時間且紫外吸收光譜一致的峰（詳見表2），說明該方法專屬性良好。

2.5.2 精密度試驗 取陳皮藥材CP21061504，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件連續進樣5針，每次進樣10 μL，將得到5針AIA數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算軟件進行分析，參數設置為：以供試品1-1（S1）色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.3;多點校正;全峰匹配，計算相似度結果，并對指紋圖譜中8個明顯特征峰進行標記，計算7個標記峰與標記S峰（橙皮苷）的相對保留時間及相對峰面積，如圖2所示。結果表明，連續進樣的5針供試品溶液指紋圖譜相似度均大于0.99，各供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，7個明顯特征峰的峰相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積小于5.0%，說明該儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取陳皮藥材CP21061504，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件各進樣10 μL，將得到的AIA數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算軟件進行分析，參數設置為：以供試品1（S1）色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.3;多點校正;全峰匹配，計算相似度結果，計算7個標記峰與標記S峰（橙皮苷）的相對保留時間及相對峰面積，如圖3所示。結果表明，6個供試品呈現出的色譜相似度均大于0.99，各供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，特征峰（同精密度項下）相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD均小于5.0%，說明該方法重復性良好。

2.5.4 溶液穩定性試驗 取陳皮藥材CP21061504，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h按照“2.4”項下色譜條件各進樣10μL進樣檢測，將得到的AIA數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算軟件進行分析，參數設置為以0 h（S1）色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.3;多點校正;全峰匹配，計算相似度結果，計算7個標記峰與標記S峰（橙皮苷）的相對保留時間及相對峰面積，如圖4所示。結果表明，不同時間點測得的色譜相似度均大于0.99，各時間點供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，特征峰（同精密度項下）相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD均小于7.0%，該供試品溶液在常溫放置24 h內穩定性良好。

2.5.5 中間精密度考察 按照“2.4”項下色譜條件，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，取陳皮藥材CP21061504供試品溶液考察隨機變動因素不同日期、不同分析人員、不同儀器對重復性的影響，記錄色譜圖。將得到的AIA數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算軟件進行分析，參數設置為：以實驗員A供試1（S1）色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.3;多點校正8個峰;全峰匹配，計算7個標記峰與標記S峰（橙皮苷）的相對保留時間及相對峰面積，如圖5所示。結果表明，12個指紋圖譜之間的相似度均在0.96以上，與對照指紋圖譜之間的相似度均在0.99以上，各特征峰相對保留時間RSD均小于3.0%，個別色譜峰相對峰面積RSD較大，但是不影響整體識別。說明該方法中間精密度良好。

2.6 評價標準的確定 按照“2.4”項下色譜條件，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，對17批陳皮藥材供試品溶液進行指紋圖譜檢測，將17批陳皮藥材指紋圖譜與陳皮藥材對照指紋圖譜AIA數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算軟件進行分析，參數設置為：以S1（藥材對照指紋圖譜）為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.3;多點校正8個峰;全峰匹配，計算陳皮藥材與藥材對照指紋圖譜的相似度，結果如圖6所示。結果顯示，17批陳皮藥材與陳皮藥材對照特征圖譜的相似度均在0.90以上，表明陳皮藥材、陳皮藥材特征圖譜具有相關性。

計算各特征峰與S峰的相對保留時間，17批陳皮藥材特征峰相對保留時間分別為：峰1在0.476～0.483范圍內，峰2在0.895～0.897范圍內，峰4在1.387～1.396范圍內，峰5在1.871～1.887范圍內，峰6在2.013～2.031范圍內，峰7在2.176～2.196范圍內，峰8在2.307～2.328范圍內，均符合陳皮藥材特征圖譜標準規定。故最終建立陳皮藥材特征圖譜標準同藥材，即供試品特征圖譜中應呈現8個特征峰，與參照物（橙皮苷）峰相應的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，應在規定值的加減10%范圍內。相對保留時間規定值為0.486（峰1）、0.898（峰2）、1.380（峰4）、1.874（峰5）、1.996（峰6）、2.153（峰7）、2.287（峰8）。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 以色譜峰個數、整體分布、制備難易等為指標，采用單因素考察方法，對供試品溶液提取方法、提取時間、提取溶媒等進行了研究。對比了加熱回流30 min、超聲處理（功率900 W，頻率60 kHz）30 min兩種提取方式獲得的供試品溶液指紋圖譜情況，結果表明回流和超聲兩種提取方式所呈現的色譜圖基本一致，考慮到超聲相對較為簡便，選擇超聲提取。先對比甲醇、乙醇、水所提取得色譜峰差異進行判斷，再根據結果考察不同濃度的溶劑對呈批指紋圖譜的影響，結果表明甲醇作為提取溶媒時色譜峰個數明顯多于乙醇和水，隨著提取溶媒中甲醇占比越高，所提取的色譜峰越多，各峰分離度均良好，故選擇甲醇作為樣品前處理提取溶劑。對比了不同提取時間（超聲處理15 min、30 min、45 min、60 min）制備的陳皮供試品溶液指紋圖譜差異，不同提取時間制得的供試品溶液得到的色譜圖基本一致，選擇提取時間較為適中的30 min。最終確定陳皮指紋圖譜檢測用供試品溶液制備方法。

3.2 檢測波長確定 結合確定的方法所測陳皮指紋圖譜的3D圖（時間-波長-響應值）分析可知，250～350 nm波長呈現的色譜峰相對較多，其中部分色譜峰在各波長下均展示有較強的吸收，分析陳皮中該三種成品含量較高。對比250～350 nm波長范圍內指紋圖譜可知，色譜峰283 nm波長下呈現的色譜峰個數較多，比例分布相對其他更為均勻，且參照峰橙皮苷具有較高的響應值，整體譜圖呈現良好，故選擇283 nm為陳皮指紋圖譜檢測波長。

3.3 流動相的考察研究 本試驗分別考察“乙腈-0.1%甲酸溶液”“乙腈-水”“乙腈-0.1%醋酸溶液”“乙腈-0.1%磷酸溶液”流動相體系中對陳皮指紋圖譜的影響。結果顯示，不同流動性體系對色譜峰洗脫影響不一致，其中“乙腈-0.1%甲酸溶液”色譜峰明顯多于其他三種流動相體系，故選擇“乙腈-0.1%甲酸溶液”為陳皮指紋圖譜流動相體系。

3.4 特征峰的確認 17批陳皮藥材中共有峰31個，統計對照指紋圖譜中各共有峰中峰面積占共有峰總峰面積百分比可知，除橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰外，其他占總峰面積比值均低于2%，考慮到批次間質量化學成分含量存在差異，峰面積較小、分離度較差的共有峰受檢測條件等影響較大，不適宜作為特征峰用于藥材的質量控制，故選擇占總峰面相對較大（占總峰面積0.5%）、響應值較高、分離度較好的共有峰作為特征峰，經評估，陳皮藥材對照指紋圖譜中不低于總峰面積0.5%色譜峰有10個，但其中有兩個峰分離度較差，在不同批次間呈現較弱，不適宜作為特征峰，故選擇占總峰面較大、響應值較高、分離度較好的共有峰作為其特征峰，故本研究建立了以8個特征峰為指標成分的陳皮HPLC指紋圖譜，對其中3個峰進行了峰歸屬，確定為橙皮苷、川陳皮素、桔皮素，其余5個色譜峰還需進一步研究確認。

綜上，以Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以乙腈—0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫）為流動相;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為283 nm，采用HPLC法測定，該方法經過方法學驗證，可用于陳皮藥材的質量控制。

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（收稿日期：2022-01-07 編輯：徐 雯）