弩藥液的鎮痛作用及對炎性疼痛因子TNF-α、IL-6和PGE2的影響

梁瀟 劉嬌 胡濤 阮婧華 錢海兵

【摘 要】 目的：研究苗藥制劑弩藥液的鎮痛作用及作用機制，為弩藥液的臨床應用提供藥理學基礎。方法：采用小鼠熱板實驗，雄性ICR小鼠40只，隨機分為模型組，弩藥液高、中、低劑量組，每組10只，連續7d腹部涂抹給藥后測定末次給藥后小鼠30min、60min、90min痛閾值;采用小鼠扭體實驗，ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機分為模型組，弩藥液高、中、低劑量組，納絡酮+高劑量組，每組10只，連續7d腹部涂抹給藥后腹腔注射0.8%冰醋酸生理鹽水溶液，隨即記錄小鼠扭體潛伏期和15min內扭體次數;采用大鼠福爾馬林致痛實驗，SD大鼠30只，雌雄各半，隨機分為空白組，模型組，弩藥液高、中、低劑量組，每組6只，連續7d腹部涂抹給藥后于大鼠右足底皮下注射5%福爾馬林生理鹽水溶液，隨即記錄大鼠第一時相和第二時相舔咬后足持續時間，并且檢測大鼠血清炎性疼痛因子TNF-α、IL-6和PGE2濃度。結果：熱板實驗中，小鼠給藥后30min和60min高劑量組與模型組以及高劑量組給藥后60min和90min與給藥后30min痛閾值比較，均有顯著性差異（P<0.05）;扭體實驗中，模型組、低劑量組及納絡酮+高劑量組與高劑量組潛伏期及扭體次數比較均有顯著性差異（P<0.05）;福爾馬林致痛實驗中，各組大鼠舔咬后足持續時間第一時相無顯著性差異（P>0.05），高、中劑量組與模型組舔咬后足持續時間第二時相比較，有顯著性差異（P<0.05），空白組、高劑量組和中劑量組大鼠血清IL-6、PGE2濃度均與模型組比較，有顯著性差異（P<0.05），空白組血清TNF-α濃度與模型組比較，有顯著性差異（P<0.05），給藥組血清TNF-α濃度較模型組有所降低，但無顯著性差異（P>0.05）。結論：弩藥液對多種疼痛模型具有顯著鎮痛作用，可能作用于阿片類受體，作用機制可能與顯著下調炎性疼痛因子IL-6、PGE2有關。

【關鍵詞】 苗藥制劑;弩藥液;鎮痛作用

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）13-0017-04

Analgesic Effect of Crossbow Liquid and its Effect on Inflammatory Pain Factors TNF-α， IL-6 and PGE2

LIANG Xiao1 LIU Jiao1 HU Tao1 RUAN Jinghua2 QIAN Haibing1*

1.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China;2.First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China

Abstract：Objective To study the analgesic effect and possible mechanism of Nuyaoye， miao medicine preparation， to provide pharmacological basis for clinical application of Nuyaoye.Methods Forty Female ICR mice were randomly divided into model group， high-dose， medium-dose and low-dose groups with 10 mice in each group. The pain threshold of 30min，60min and 90min after the last administration was measured after 7 days of abdominal smear.A total of 50 ICR mice （Male and female half） were randomly divided into model group， high-dose， medium-dose and low-dose naloxone + high-dose groups， with 10 mice in each group. After 7 days of abdominal administration，0.8% glacial acetic acid normal saline solution was intraperitoneally injected. The latency period of writhing and the number of writhing within 15 minutes were recorded.Using rats foer Ma Linzhi pain experiment， 30 SD rats（Male and female half） were randomly divided into blank group， model group， crossbows， solution of high， middle， low dose group， each group of six， seven d rats after abdominal daub to right plantar subcutaneous injection of 5% formalin saline solution， then record first and 2 in the first phase of rats lick bite after sufficient duration， Serum concentrations of inflammatory pain factors TNF-α， IL-6 and PGE2 were detected.Results In the hot plate experiment， there were significant differences between the pain threshold of the high-dose group and the model group 30min and 60min after administration， and the pain threshold of the high-dose group 60min and 90min after administration and 30min after administration （P<0.05）. In the writhing experiment， there were significant differences in latency and writhing times between the model group， low-dose group， naloxone + high-dose group and high-dose group （P<0.05）. In the formalin-induced pain experiment， there was no significant difference in the first phase of the licking hind foot duration among all groups （P>0.05）， but there was a significant difference in the second phase of the licking hind foot duration between the high-dose and medium-dose groups and the model group （P<0.05）. The serum concentrations of IL-6 and PGE2 in blank group， high-dose group and medium-dose group were significantly different from those in model group （P<0.05）. The serum concentrations of TNF-α in blank group were significantly different from those in model group （P<0.05）. The serum concentrations of TNF-α in administration group were decreased compared with that in model group， but there was no significant difference （P>0.05）.Conclusion The miaoyao preparation Nuyaoye has significant analgesic effects on various pain models， which may act on opioid receptors， and the mechanism of action may be related to the significant down-regulation of inflammatory pain factors IL-6 and PGE2.

Key words：Miaoyao Preparation;Nuyaoye;Analgesic

國際疼痛研究學會將疼痛定義為“一種與實際或潛在組織損傷相關的感覺、情感、認知和社會維度的痛苦體驗”[1]，疼痛反應嚴重影響患者的生活。我國民族藥藥物資源豐富，且有多種鎮痛藥物及制劑應用于臨床并取得顯著的效果，從傳統藥物中尋找副作用小且鎮痛效果顯著的藥物已成為當前研究熱點。苗藥弩藥液為外用制劑，具有活血化瘀-祛風止痛的功效，臨床用于骨關節炎、類風濕等引起的關節疼痛，亦可用于癌性疼痛輔助治療，主要由大血藤、飛龍掌血、透骨香、白屈菜和黑骨藤組方而成，實驗研究[2-6]表明，以上藥物對多種疼痛模型均具有顯著鎮痛作用。

本研究采用熱板實驗、醋酸扭體實驗和福爾馬林致痛實驗，以行為學和血清疼痛因子水平為指標，研究弩藥液的鎮痛作用以及可能的作用受體及機制，旨在闡明弩藥液對不同疼痛模型的作用，為其臨床應用提供藥理學實驗基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 ICR小鼠（雌性75，雄性25），體質量（20±2）g;SD大鼠（雌性15，雄性15），體質量（200±20）g。所有動物購于長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0014，適應性喂養7d后參照文獻[7-8]進行實驗。

1.2 藥物及試劑 弩藥液由貴州中醫藥大學第一附屬醫院提供，取原液為高劑量、稀釋一倍為中劑量、稀釋兩倍為低劑量;納絡酮（批號：MB5693，大連美侖生物技術有限公司），配制成5mg/kg的納絡酮生理鹽水溶液;福爾馬林（批號：20170204，重慶江川化工集團有限公司），配制成5%福爾馬林生理鹽水溶液;冰醋酸（批號：20190221，國藥集團化學試劑有限公司），配制成0.8%冰醋酸生理鹽水溶液;大鼠IL-6（Interleukin 6，批號：KKSX3XLXAQ）、TNF-α（Tumor Necrosis Factor Alpha，批號：CFDS7MDM1E）、PGE2（Prostaglandin E2，批號：F21MQ8N8J6）ELISA試劑盒。

1.3 儀器 熱板測痛儀（由貴州中醫藥大學提供）、JJ224BF型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠，編號：W162419080116）、80-1醫用離心機（江蘇新康醫療器械有限公司）、Infinite M200酶標儀（北京新風機電技術公司）。

1.4 小鼠熱板舔足實驗 雌性ICR小鼠50只，置于55℃熱板測痛儀上，以小鼠初次舔咬后足反應潛伏期為痛閾指標即痛閾值（s），間隔20min測定兩次，取平均值作為基礎痛閾值，隨機選擇40只基礎痛閾值在5～30s內且無跳躍反應小鼠進入實驗，隨機分為模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。小鼠腹部以給藥面積1.5cm2備皮，模型組涂抹生理鹽水，高、中、低劑量組分別均勻涂抹相應藥物，2次/d，連續7d，末次給藥后30min、60min、90min各組小鼠分別測定痛閾值（s），計算痛閾提高百分率=（給藥后痛閾值-基礎痛閾值）×100%/基礎痛閾值。

1.5 小鼠納絡酮拮抗-醋酸扭體實驗 ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、納絡酮+高劑量組，每組10只。除模型組外，其余各組按1.3項下方法給藥，末次給藥后45min，除納絡酮+高劑量組腹腔注射納絡酮溶液（5mg/kg，0.1mL/10g）外，其余各組均腹腔注射生理鹽水（0.2mL/只），15min后，模型組和納絡酮組涂抹生理鹽水，其余各組分別涂抹相應藥物，40min后各組均腹腔注射0.8%冰醋酸生理鹽水溶液（0.1mL/10g），立即觀察并記錄各組小鼠初次出現扭體反應時間即扭體潛伏期（s）和15min內出現扭體反應的次數，15min內未出現扭體的，潛伏期記為900s，計算鎮痛百分率=（模型組扭體次數-給藥組扭體次數）×100%/模型組扭體次數。

1.6 大鼠福爾馬林致痛實驗 SD大鼠30只，雌雄各半，隨機分為空白組、模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組6只，按1.3項下方法給藥（空白組參照模型組給藥方式），末次給藥30min后，除空白組外，其余各組大鼠右側后足皮下注射5%福爾馬林100μL，以皮丘形成為注射成功，立即觀察并記錄各組大鼠第一時相（0～5min）和第二時相（15～60min）舔咬后足持續時間（s），作為疼痛評價指標。實驗完成后，各組大鼠采用腹主動脈取血，于離心機分離血清，按照ELISA試劑盒說明書分別測定IL-6、TNF-α和PGE2濃度。

1.7統計分析 數據采用平均值加減標準差（x±s）表示，SPSS 26.0進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 行為學實驗結果

2.1.1 小鼠熱板舔足實驗 各組小鼠基礎痛閾值相比較無顯著性差異（P>0.05），給藥后30min和60min高劑量組與模型組痛閾值相比有顯著性差異（P<0.05）;高劑量組給藥后60min和90min的痛閾值與給藥后30min相比均有顯著性差異（P<0.05），各組給藥后60min和90min的痛閾值相比無顯著性差異（P>0.05）。見表1。

2.1.2 小鼠納絡酮拮抗-醋酸扭體實驗 模型組、低劑量組及納絡酮+高劑量組與高劑量組潛伏期及扭體次數相比均有顯著性差異（P<0.05）。見表2。

2.1.3 大鼠福爾馬林致痛實驗 各組大鼠舔咬后足持續時間第一時相相比無顯著性差異（P>0.05），高、中劑量組與模型組舔咬后足持續時間第二時相相比有顯著性差異（P<0.05）。見表3。

2.2 血清指標 空白組、高劑量組和中劑量組大鼠血清IL-6濃度均與模型組相比有顯著性差異（P<0.05）;空白組血清TNF-α濃度與模型組相比有顯著性差異（P<0.05）;空白組、高劑量組和中劑量組血清PGE2濃度與模型組相比有顯著性差異（P<0.05）。見表4。

3 討論

疼痛是炎癥和癌癥等病理狀態下機體的主要反應[9]。本實驗采用物理刺激和化學刺激兩種致痛模型，以行為學和血清致痛因子濃度為指標研究弩藥液的鎮痛作用。

熱板法是篩選鎮痛藥物的一個經典的熱刺激致痛法[10]。實驗結果顯示弩藥液能夠顯著降低小鼠熱板致痛模型末次給藥后30min和60min的痛閾值，高劑量組在末次給藥后30min的痛閾值與末次給藥后60min和90min均有顯著性差異，說明弩藥液對小鼠熱板致痛模型具有顯著鎮痛作用，且在末次給藥后30min的鎮痛作用最為顯著。

醋酸扭體法是篩選鎮痛藥物的一個常用化學刺激致痛法[10]。實驗結果顯示弩藥液能夠顯著減少小鼠醋酸扭體致痛模型扭體潛伏期和15min內的扭體次數，說明弩藥液對小鼠醋酸扭體致痛模型具有顯著鎮痛作用，實驗進一步加入納絡酮拮抗組，結果顯示納絡酮能顯著拮抗弩藥液的鎮痛作用，納絡酮是阿片類受體拮抗劑，說明弩藥液的鎮痛作用可能作用于阿片類受體。

福爾馬林致痛法是經典的炎癥致痛模型，第二時相為體內炎癥因子大量產生而導致疼痛的時期[10]。實驗結果顯示弩藥液能夠顯著減輕大鼠福爾馬林致痛模型第二時相舔咬后足反應的持續時間，說明弩藥液對大鼠福爾馬林致痛模型具有顯著鎮痛作用，且可能與下調炎癥因子表達有關。

炎性疼痛是疼痛的主要類型[11]，IL-6、TNF-α和PGE2是與疼痛相關的炎癥細胞因子，福爾馬林致炎后大鼠體內炎癥細胞因子濃度升高，促進疼痛產生[12]。實驗結果顯示，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α和PGE2濃度均顯著升高，說明造模成功，弩藥液高劑量組和中劑量組血清中IL-6和PGE2濃度與模型組相比均顯著性降低，TNF-α濃度與模型組相比呈降低趨勢但差異不顯著，即弩藥液可顯著降低血清中IL-6和PGE2濃度，降低TNF-α濃度，說明弩藥液的對大鼠福爾馬林致痛模型的鎮痛作用可能與顯著下調IL-6、PGE2濃度有關，而與TNF-α濃度相關性不大。

綜上所述，弩藥液可能是阿片類鎮痛藥，對多種疼痛模型具有顯著鎮痛作用，且對炎性疼痛模型的作用可能與下調炎性因子表達有關，但具體機制仍需實驗驗證。

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（收稿日期：2021-11-02 編輯：陶希睿）