痛舒膠囊臨床最大耐受劑量實驗中4種成分藥物濃度測定方法建立

趙高瓊 劉紅斌 崔佳麗 梅晶 周藝佳 王京昆

【摘 要】 目的：建立痛舒膠囊中指標性成分梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1在人血漿中的LC-MS/MS濃度檢測方法，并對該方法進行驗證，以經過驗證的方法，對來自痛舒膠囊臨床MTD（最大耐受量）實驗的血漿樣本進行藥物濃度檢測，獲得志愿者口服給予痛舒膠囊后體內的藥物濃度水平。方法：色譜柱：Waters SunFire C18（4.6mm×150mm，5μm）;流動相：A 為0.01%甲酸水，B 為甲醇;梯度洗脫：0～1min，90% A;1～8min，90%～10% A;8～10min，10% A;10～10.5min，10%～90% A;10.5～15min，90% A。流速：1mL/min。柱溫：20℃;進樣量：10μL。離子源：ESI 源，正離子模式，MRM 掃描。結果：梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1及內標鹽酸普萘洛爾提取離子色譜圖與血漿中內源性雜質互不干擾。以鹽酸普萘洛爾為內標，梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1的檢測范圍分別為252～8100ng/mL、26.8～858ng/mL、32.8～1050ng/mL、11.2～361ng/mL。各成分日內精密度與日間精密度RSD≤15%，準確度分別在85%～115%之間，提取回收率在61.05%～96.54%之間?；|對4個成分各濃度間的影響基本一致。結論：該方法快速、靈敏、重復性好，可用于痛舒膠囊中4 種有效成分在人體內的MTD試驗樣本藥物濃度檢測。

【關鍵詞】 痛舒膠囊;梔子苷;人參皂苷Rg1;三七皂苷R1;人參皂苷Rb1

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）13-0021-05

The Method of Determination of the concentration of 4 ingredients in the clinical MTD experiment of Tongshu capsule

ZHAO Gaoqiong1，2 LIU Hongbin1，2 CUI Jiali1，2 MEI Jing1，2 ZHOU Yijia1，2 WANG Jingkun1，2*

1.Yunnan Institute of Materia Medica，Kunming 650111，China;2.Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation，Kunming 650111，China

Abstract：

Objective To establish a method that detect the concentration of major components：geniposide， ginsenoside Rg1， notoginsenoside R1 and ginsenoside Rb1 of Tongshu capsule in human plasma utilizing LC-MS/MS， then validate this methodology. With proven methods， detecting drug concentration in plasma samples form volunteers that experienced clinical MTD（Maximum Tolerance Dose） experiment， Tongshu capsule dosed orally.Methods The chromatographic column： Waters Sun Fire C18（4.6mm×150mm， 5μm）. Mobile phase： A is 0.01% formic water， B is methanol. Gradient elution： 0-1min， 90%A; 8-10min，10% A;10-10.5min， 10%-90% A; 10.5-15min， 90% A. Flow rate：1mL·min-1.Column temperature： 20℃. Injection volume： 10μL. Ion source： ESI， positive ion mode， MRM scan.Results The ion chromatograms of geniposide， ginsenoside Rg1， notoginsenoside R1， ginsenoside Rb1 and internal standard of Propranolol hydrochloride were not interfered with the endogenous impurities in the plasma. The detection ranges of Geniposide， ginsenoside Rg1， notoginsenoside R1 and ginsenoside Rb1 were 252-8100ng/mL， 26.8-858ng/mL， 32.8-1050ng/mL and 11.2-361ng/mL. Respectively， The inday precision and day precision RSD of each component was ≤15%， the accuracy ranged from 85% to 115%， and the extraction recovery ranged from 61.05% to 96.54%. The effects of substrate on the concentrations of the four components were basically consistent.Conclusion This method is rapid， sensitive and reproducible， and can be used to detect the concentration of 4 active ingredients in tongshu capsule in human MTD test samples.

Key words：Tongshu Capsule; Gardenin; Ginsenoside Rg1; Notoginsenoside R1; Ginsenoside Rb1

痛舒膠囊是根據云南彝族經驗方開發的民族藥，其主要由七葉蓮、三七、梔子、燈盞細辛、玉葡萄根、珠子參等八味中藥組方而成，具有活血化瘀，舒筋活絡，化痞散結，消腫止痛的功效。臨床常用于治療關節炎[1] 、肩周炎[2]、頸源性頭痛[3-4]、乳腺增生[5]等。由于制劑中三七具有活血作用，且在制劑中占比最大，含量最高，故選擇三七中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1為指標性成分，同時再選擇具有消腫作用的梔子中的特征性成分梔子苷為指標性成分，建立這4種成分在人體內藥物濃度測定方法，開展痛舒膠囊在人體內的特征性多指標成分體內藥代研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國Agilent-ABI三重四級桿液質聯用儀（安捷倫公司）、Allegra 64R高速冷凍臺式離心機（Beckman公司）、SK8200LHC超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）、XW-80渦旋混合器（上海精科實業有限公司）、MD200氮氣吹掃儀（杭州奧盛儀器有限公司）、DV215CD電子天平（OHAUS）。96孔板固相萃取裝置、96孔固相萃取板（Oasis HLB μElution Plate 30μm）均購買自美國waters公司。

1.2 材料 對照品梔子苷（簡稱Gen，中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-201316）、人參皂苷Rg1（簡稱Rg1，中國食品藥品檢定研究院，批號：110703-201529）、三七皂苷R1（簡稱R1，中國食品藥品檢定研究院，批號：110745-201318）、人參皂苷Rb1（簡稱Rb1，中國食品藥品檢定研究院，批號：110704-201424）均購于中國藥品生物制品檢定所。鹽酸普萘洛爾（簡稱Pro，Sigma公司，美國，批號：BCBJ2807V）。甲醇（Merck公司，美國，色譜純）、甲酸（上海阿拉丁生化科技有限公司，色譜純）。水為超純水（Millipore純水，超純水系統制備）。

1.3 藥品 痛舒膠囊（規格為0.3g/粒，批號：SMA1501，云南白藥集團股份有限公司）。

2 方法

2.1 對照品溶液及內標溶液配制

2.1.1 標準曲線對照品溶液的配制 精密稱取Gen、Rg1、R1、Rb1對照品，配制成濃度分別為0.243、0.231、0.253、0.260mg/mL的標準曲線對照品儲備液，2～8℃保存，備用。取Gen、Rg1、R1、Rb1標準曲線用對照品儲備液適量，配制得到濃度分別為81.0、8.57、10.5、3.60μg/mL的混合標準曲線工作液，并用甲醇逐級稀釋（每級稀釋倍數為2倍，共稀釋5次）得到6級不同濃度的混合標準曲線工作液。

2.1.2 質控對照品溶液的配制 精密稱取Gen、Rg1、R1、Rb1對照品，配制成濃度分別為0.217、0.194、0.207、0.205mg/mL的質控用對照品儲備液，2～8℃保存，備用。取Gen、Rg1、R1、Rb1質控用對照品儲備液適量，配制得到濃度分別為72.3、7.20、8.40、2.85μg/mL的高濃度混合質控工作液，并用甲醇逐級稀釋得到濃度分別為18.1、1.80、2.10、0.712μg/mL的中濃度混合質控工作液及濃度分別為4.52、0.450、0.525、0.178μg/mL的低濃度混合質控工作液。

2.1.3 內標溶液的配制 精密稱取Pro對照品6.59mg，置于適量容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度0.659mg/mL的內標對照品儲備液，2～8℃保存，備用。取適量Pro內標儲備液，加入適量甲醇，稀釋得到濃度為110ng/mL的內標工作液。

2.2 血漿樣品處理方法 固相萃取板分別以300μL甲醇、300μL超純水活化，備用。取不同濃度的混合對照品溶液及內標工作液各10μL于離心管中，氮氣吹干。加入100μL空白人血漿，渦旋混勻，加入100μL 20%的甲酸，漩渦混勻2min后轉移至固相萃取板中，分別以200μL超純水淋洗，200μL甲醇洗脫，甲醇洗脫液10μL進樣。

2.3 LC-MS/MS檢測方法

2.3.1 液相色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱（5μm，150mm×4.6mm）;流動相：0.01%甲酸水A-甲醇B，梯度洗脫，0～1min，90% A;1～8min，90%～10% A;8～10min，10% A;10～10.5min，10%～90% A;10.5～15min，90% A，流速：1mL/min。柱溫：20℃;進樣量：10μL。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子化（ESI），正離子模式。多反應監測（MRM）定量：Gen，[M+Na]+，m/z：411.10/217.00;Rg1，[M+Na]+，m/z：823.40/203.20;R1，[M+Na]+，m/z：955.60/775.50;Rb1，[M+Na]+，m/z：1131.50 /365.10;Pro，[M+H]+，m/z：260.20/183.10。質譜參數CUR：20.00;IS：5500.00;TEM：500.0℃;GS1：50.00;GS2：50.00;CAD：Mediμm;Interface Heater（ihe）：on。

3 結果

3.1 專屬性 按照“2.2”項下方法處理，分別得到空白離子色譜圖、含標準品和內標的離子色譜圖及未知濃度血漿樣品離子色譜圖。結果表明，Gen、Rg1、R1、Rb1及Pro提取離子色譜圖與血漿中內源性雜質互不干擾。結果如圖1所示。

3.2 標準曲線與定量范圍 按照“2.2”項下方法處理，得到不同濃度系列的進樣溶液，測定得到待測成分與內標的峰面積。以各待測成分的濃度為橫坐標，待測成分與內標峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，所有待測成分的線性關系良好（r>0.95），定量范圍較寬，定量限低，所有定量下限均滿足S/N≥10。其中，Gen、Rg1、R1、Rb1 3個批次所測定標準曲線的相關系數（r）平均值分別為為0.9954、0.9978、0.9965、0.9928，相對標準偏差分別為0.12%、0.05%、0.48%、0.48%;斜率的平均值分別為4.40×10-2、5.72×10-3、2.06×10-3、13.1×10-3，相對標準偏差分別為17.38%、12.77%、14.43%、4.64%;標準曲線上各點的準確度均符合要求;線性范圍分別為252～8100ng/mL、26.8～857ng/mL、32.8～1050ng/mL、11.2 ～360ng/mL。

3.3 殘留率 按照“2.2”項下方法處理，得到標準曲線最高濃度點的進樣溶液及空白血漿溶液，平行處理6份，按“最高濃度點樣品-空白血漿樣品”次序交叉測定所有制備的樣品，各空白血漿中待測成分Gen、Rg1、R1、Rb1及內標Pro的峰面積與定量下限樣品測定峰面積的比值，其中待測成分殘留率均小于20%，內標殘留率小于5%，滿足試驗要求。

3.4 精密度、準確度 取定量下限、低、中、高4個濃度的的加標血漿，按照“2.2”項下方法分別處理得到4個濃度的進樣溶液，每個濃度處理3批次，每批次每個濃度平行處理6份，計算日內精密度、日間精密度及準確度。結果表明，痛舒膠囊中4種入血成分的日內精密度、日間精密度RSD≤15%，定量下限準確度均在80%～120%之間，質控樣品準確度均在85%～115%之間，符合試驗要求。見表1。

3.5 回收率 按照“2.2”項下方法平行處理6份低、中、高3個濃度的加標血漿，得提取后的進樣溶液。再取相同濃度的混標溶液，平行6份，得未提取的標準進樣溶液。分別測定12個進樣溶液。計算提取后進樣溶液與未提取進樣溶液測定濃度的比值，得到提取回收率。結果痛舒膠囊中4個入血成分Gen、Rg1、R1、Rb1不同濃度間的平均回收率分別為91.65%、64.39%、84.72%、86.11%，回收率在61.05%～96.54%之間，各入血成分各濃度間回收率RSD均≤15%，符合試驗要求。

3.6 基質效應 按照“2.2”項下方法，平行6個不同個體的人空白血漿，每個個體平行處理3份，得到18份空白基質樣品。離心管中分別加入低、中、高濃度混合標準溶液及內標溶液，氮氣吹干，加入空白基質復溶，得到含基質的進樣溶液，每個濃度平行處理6份。再取相同濃度的混標溶液，平行6份，得不含基質的標準進樣溶液。計算歸一化基質效應因子。結果顯示人血漿對Gen、Rg1、R1、Rb1各濃度間的基質影響均較小，且影響程度均基本一致，基質效應RSD均≤15%，滿足試驗要求。

3.7 血漿樣品及進樣溶液穩定性 按照“2.2”項下方法，處理低、高兩個濃度的質控樣品，每個濃度平行6份，室溫放置5d后進樣。制備低、高兩個濃度的加標血漿樣品，分別于室溫放置6h、-80℃放置164d、-80℃放置164d且反復凍融3次后按照“2.3”項下方法處理進樣，每個濃度平行6份。結果表明含藥血漿可在室溫穩定放置6h、-80℃放置164d、可反復凍融3次，進樣溶液可室溫穩定放置5d，穩定性考察條件滿足試驗需求。見表3。

綜上，本試驗條件下，所建立的HPLC-MS/MS法能用于對來自于臨床MTD的所有人血漿樣本中梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1的檢測，該方法靈敏度高、重現性好、穩定性高。

4 討論

由于人血漿中基質比較復雜，基質可隨目標成分共提出或共流出，對前期摸索階段建立的分析方法造成干擾，基質效應對不同濃度間目標成分影響差異較大。為排除基質對分析檢測的影響，首先優化含藥血漿樣品處理方法。通過對不同提取方法的考察后篩選出對不同濃度間目標成分影響較小的固相萃取法為樣品前處理方法。然后又對固相萃取法洗脫溶劑、溶劑洗脫比例、溶劑洗脫體積等因素進行考察，結果發現有基質能隨洗脫溶劑甲醇共流出，無法通過樣品前處理方法完全排除基質對分析檢測的干擾。因此，為徹底排除基質對分析檢測的影響，本實驗同步優化分析檢測方法，選擇柱長為150mm的色譜柱對隨目標成分共流出的基質進行分離，通過調整流動相比例、流動相梯度、流動相種類等方式實現對基質的分離，從而保證基質效應對樣品分析檢測影響的一致性。

在試驗過程中，血漿樣品及進樣溶液穩定性僅對低濃度及高濃度質控進行驗證，驗證濃度能覆蓋痛舒膠囊臨床MTD血漿樣本中的濃度。根據樣品存放條件及時間，設置血漿樣品長期穩定性考察，考察周期為164d，考察周期可覆蓋血漿樣品的存放周期。

本次實驗所選擇的檢測目標物，均為原型化合物，由于中藥復方的復雜性，這一階段并未對其可能的代謝產物進行檢測，這些化合物有可能在進入人體后發生代謝轉化，導致原型化合物難以被跟蹤到[6-8]，后續試驗將提高儀器靈敏度，或對原型化合物及代謝產物進行研究分析，以揭示痛舒膠囊的體內吸收過程。

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（收稿日期：2011-11-08 編輯：陶希睿）