固本平喘方納米脂質體霧化吸入劑改善哮喘豚鼠病理狀態的研究

貫劍 宋紅普 張曉曉 張彤

【摘要】目的：研究固本平喘方霧化吸入后治療效果。方法：將39只豚鼠分為正常對照組、哮喘模型組、中藥對照組、固本平喘吸入劑小劑量組、固本平喘吸入劑大劑量組、西藥對照組6組，采用固本平喘中醫納米脂質體霧化吸入，觀察一般情況、血常規和病理改變。結果：模型組與其他組比較，白細胞（WBC）、嗜酸性細胞（EO）水平明顯升高，差異有統計學意義。正常組由于霧化等因素影響，存在肺動脈壁增厚和輕微炎癥的情況。哮喘模型組的炎癥情況最為嚴重，動脈壁增厚。中藥對照組炎癥情況減輕，伴有肉芽組織增生。結論：固本平喘方納米脂質體霧化吸入劑對哮喘豚鼠的病理學有一定的改善作用。

【關鍵詞】固本平喘方;霧化吸入;哮喘;豚鼠;病理學

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2022）11-0009-05

StudyonthePathologicalStateoftheNebulizedNanoliposome

InhalationofGubenPingchuanFormulaonAsthmaticGuineaPigs

GUANJian1SONGHongpu2ZHANGXiaoxiao3ZHANGTong2

1.LiangyuanHospitaloftraditionalChinesemedicine，Shangqiu476000，China;

2.ShanghaiUniversityoftraditionalChinesemedicine，Shanghai200030，China;

3.PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityoftraditionalChinesemedicine，Shanghai200062，China

Abstract：ObjectiveToassesstheinhalationtherapyofnebulizedGubenPingchuan.Method39guineapigsweredividedintosixgroups：normalcontrolgroup，asthmamodelgroup，traditionalChinesemedicinecontrolgroup，GubenPingchuanlow-doseinhalationgroup，GubenPingchuanhigh-doseinhalationgroup，andWesternmedicinecontrolgroup.ThenebulizednanoliposomesofGubenPingchuanwereinhaledbythesixgroupsandwemeasuredtheallergy-relatedimmunologicalindicators.ResultThelevelsofWBCandeosinophil（EO）weresignificantlyhigherinmodelgroupandothergroups.Thenormalgrouphadpulmonaryarterywallthickeningandslightinflammationduetoatomizationandotherfactors.Theinflammationofasthmamodelgroupwasthemostserious，andthearterialwallwasthickened.Inthecontrolgroup，inflammationwasalleviated，accompaniedbygranulationtissuehyperplasia.ConclusionThenebulizednanoliposomeinhalationofGubenPingchuancouldimprovethepathologyofasthmaticguineapigstoacertainextent.

Keywords：GubenPingchuanFormula;NebulizedInhalation;Asthma;GuineaPigs;Pathologically

固本平喘方具有益氣平喘、脫敏解毒的功效，筆者在臨床上長期使用霧化吸入劑治療哮喘有較好效果，但方式多為簡單的霧化吸入，多數臨床觀察[1-3]僅停留在經驗層面，實驗研究的機理不明確，本項研究，通過動物實驗來客觀地觀察和評價其治療效果，探討其在細胞的作用機理。

1實驗材料

1.1藥物

1.1.1治療用藥固本平喘霧化吸入劑（以下簡稱固本平喘方）：每毫升含1g生藥量，由上海中醫藥大學中藥學院提供。

1.1.2陽性對照藥小青龍合劑（湖北福廣制藥有限公司生產，國藥準字Z42021495）。功能主治是解表化飲，止咳平喘，用于風寒水飲，惡寒發熱，無汗，喘咳痰稀。每支裝10mL。

1.2實驗動物英國種普通級健康豚鼠39只，體重250～300g，均由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，普通級，實驗動物合格證號[上海中醫藥大學實驗動物中心SYXK（滬）2004-0005]。

1.3設備與試劑

1.3.1設備貝爾思超聲霧化器（BSW-2A型）由鞍山市貝爾思電子有限公司生產。希森美康（XE-2100）全自動血球分析裝置，由日本SYSMEXCORPORATIION公司生產。萊卡SP1600切片機由上海萊卡儀器有限公司生產。奧林巴斯CX31顯微鏡。隔水式恒溫箱（PYX-DHS型）上海躍進醫療器械一廠生產。

1.3.2試劑卵蛋白粉（OVA），國藥集團化學試劑有限公司生產（批號：F20110811）。

2實驗方法

2.1造模方法將豚鼠正常飼養1周后開始進行致敏。第1天，先用75%乙醇溶液消毒局部皮膚后，給哮喘模型組、高劑量組、低劑量組及中藥對照組、西藥對照組每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水溶液1.6mL（6mL/kg，另有0.1mL損耗）致敏。空白對照組用0.9%生理鹽水。第8天，再次注射致敏，各組劑量和方法同前。

2.2模型評價指標第14天開始激發引喘，將豚鼠置于4L的玻璃鐘罩內用1%卵蛋白霧化吸入15～30s，觀察20～30s，誘發哮喘發作（說明模型成功）。如豚鼠出現抽搐，馬上將其取出。以后隔天進行1次引喘，至實驗結束。同時，從第14天起，引喘后1h各組進行相應治療。至第28天，各組動物處死，提取樣本。

2.3分組與治療方法A正常對照組：致敏、激發以及治療均以0.9%生理鹽水代替。B哮喘模型組：造模成功后每天吸入1%OVA溶液激發1次。C中藥對照組：霧化吸入小青龍合劑1g/次。D固本平喘吸入劑小劑量組：霧化吸入劑1g/次。E固本平喘吸入劑大劑量組：霧化吸入劑3g/次。F西藥對照組：霧化吸入地塞米松1g/次。

2.4血常規檢測采用全自動血球分析裝置自動分析血常規全套。

2.5肺組織病理學檢查各組豚鼠分別于末次激發后24h內用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下開胸。取右肺下葉組織，置4%甲醛固定，24h后酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察支氣管周圍炎性病變。

2.5.1肺組織切片制備①切取標本同一部位組織，大小約2mm×1mm×1mm;②以乙醇進行梯度脫水（80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次）;③浸二甲苯2次，以透明;④用58℃低熔點石蠟浸蠟2次;⑤包埋蠟塊;⑥5um常規切片，裱于防脫片劑處理過的干凈載玻片上;⑦置60℃恒溫箱中烤片3h，備用。

2.5.2肺組織HE染色①切片以二甲苯脫蠟2次;②以乙醇進行梯度脫水（100%乙醇3次、95%乙醇2次、80%乙醇1次）;③在蒸餾水中停留2min后，以蘇木素溶液染細胞核;④自來水沖洗，去掉浮色;⑤1%鹽酸酒精分化;⑥蒸餾水漂洗后，以1%伊紅酒精溶液染細胞質;⑦以乙醇進行梯度脫水（80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次）;⑧以二甲苯透明，樹脂膠封片。光鏡下觀察。

2.6統計學方法應用SPSS12.0統計軟件進行統計分析。所有計量數據均以均數加減標準差（x±s）方式表示，多組之間均數比較采用方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

3結果

3.1一般情況變化各組在被激發后癥狀表現不同，正常對照A組豚鼠表現精神活躍、反應靈敏、呼吸平穩，無明顯呼吸急促、困難和喘鳴音，模型組合各用藥組豚鼠在吸入OVA后不久出現躁動、搔抓顏面等情況，部分豚鼠出現呼吸急促、腹式呼吸，甚至哮鳴音等。在末次激發時，小劑量治療D組豚鼠未出現哮鳴音和呼吸困難，其他各治療組均有2～3只豚鼠出現輕度呼吸急促、喘鳴等情況。

3.2血常規變化模型組與其他組比較，WBC、EO水平明顯升高，差異有統計學意義。正常組較其他各組的EO水平均低，差異有統計學意義。D、E、F組的BA水平與模型組比較顯著增高，D、F組與C組比較亦有差異。A組與B組的PMN差別有統計意義，其余各組無差別。B組與A組比較，LY有顯著差別，D、E、F組與B組的差別也有統計學意義。詳見表1。

3.3固本喘方對病理學的影響肺組織病理學觀察變化情況，A正常對照組：支氣管及周圍肺組織結構清晰，肺動脈壁輕度增厚，有2例伴有輕度間質性肺炎。B哮喘模型組：肺動脈壁增厚，細支氣管腔內充滿炎性分泌物，有2例伴有肺間質纖維組織增生。C中藥對照組：肺內細支氣管壁及管周見少量炎細胞浸潤，腔內少量分泌物。小灶性肺組織結構破壞，伴部分肉芽組織增生。D固本平喘吸入劑小：肺動脈壁增厚，細支氣管腔內少量分泌物，3例出現輕度間質性肺炎和局部間質性肺炎。E固本平喘吸入劑大：1肺動脈壁增厚，輕度間質性肺炎。2例出現局部肺組織破壞，伴肉芽組織增生。F西藥對照組：肺動脈壁增厚，輕度間質性肺炎。2例出現肺組織結構破壞，另有1例局部肺出血。A組：圖①、②;B組：圖③、④;C組：圖⑤、⑥;D組：圖⑦、⑧;E組：圖⑨、⑩;F組：圖B11、B12（如下圖所示）。

4討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，反復接觸過敏原導致變態反應性炎癥是多數哮喘發作的基本機制。中藥復方固本平喘方（包括黃芪、白術、黃芩、甘草、麻黃、烏梅等）是臨床經驗方基礎上結合現代研究進展優化配伍而成，具有益氣平喘、脫敏解毒的功效。中藥霧化吸入劑治療哮喘有較好效果，但方式多為簡單的霧化吸入，多數臨床觀察僅停留在經驗層面，實驗研究的機理不明確。

白細胞（WBC）升高是細菌性炎癥的主要表現，但是在哮喘動物實驗中也發現存在外周血WBC增高的情況，有研究[4]表明中藥復方能顯著降低大鼠外周血WBC，較模型組有顯著差異。哮喘炎癥的特征性標志是嗜酸性細胞（EOS）的浸潤，EOS細胞漿中含有嗜酸性細胞陽離子蛋白（ECP）、堿性蛋白（MBP）、嗜酸細胞衍生的神經毒素（EDN）、嗜酸細胞過氧化物酶（EPO）等特殊蛋白質顆粒以及多種炎癥介質、細胞因子和氧自由基，EOS釋放組胺，產生氣道高反應性（AHR），因此EOS是引起遲發相變態反應和氣道高反應性的關鍵細胞，在介導氣道變應性炎癥參與支氣管哮喘發病的調節中起重要作用[5]。同時，EOS在氣道的緩解期也處于高水平，與晚期哮喘反應和氣道高反應性關系密切[6]。淋巴細胞（LY）包括T淋巴細胞和B淋巴細胞，EOS分化、成熟、聚集又依賴于淋巴細胞的活化及其產生的細胞因子來調節，因此淋巴細胞在哮喘發病中也起了關鍵作用，它影響哮喘的發生和哮喘氣道炎癥及氣道高反應性，其中T淋巴細胞具有“中樞性”調節作用[7]。筆者研究發現，模型組與其他組比較WBC、EO水平明顯升高，差異有統計學意義，說明模型組的血液中EO增多，處于一種致敏狀態。正常組較其他各組的EO水平均低，差異有統計學意義。B組與A組比較，LY有顯著差別，D、E、F組與B組的差別也有統計學意義，提示造模后的豚鼠LY明顯升高，而兩個治療組和西藥組對于豚鼠外周血的LY有降低作用。

從各組的病理結果可以看出，正常組由于霧化等因素影響，存在肺動脈壁增厚和輕微炎癥的情況。哮喘模型組的炎癥情況最為嚴重，動脈壁增厚。中藥對照組炎癥情況減輕，伴有肉芽組織增生。兩組治療組同樣有肺動脈增厚，并有輕度炎癥存在。西藥組存在肺組織結構受到破壞的情況，以上不排除外界感染的可能。

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（收稿日期：2022-02-25編輯：陶希睿）

基金項目：上海市科委項目[固本平喘霧化吸入劑對哮喘豚鼠信號轉導和轉錄激活因6（STAT6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達影響的實驗研究]。項目編號：8ZR1416200。

作者簡介：貫劍（1973-），男，滿族，博士，副主任醫師，研究方向為中醫藥治療過敏性疾病的臨床和實驗研究。E-mail：475479521@qq.com