枸櫞酸鐵銨對少突膠質細胞鐵代謝相關蛋白表達影響

王冰菁　張惠琴　謝俊霞　王俊

[摘要] 目的 探討枸櫞酸鐵銨（FAC）對未分化MO3.13少突膠質細胞鐵代謝相關蛋白表達的影響。方法 將MO3.13細胞分為對照組和FAC組。對照組給予細胞培養(yǎng)液處理，F(xiàn)AC組用加入100 μmol/L FAC的細胞培養(yǎng)液處理。處理24 h后采用蛋白質免疫印跡實驗檢測兩組細胞轉鐵蛋白受體1（TfR1）和鐵轉運蛋白1（FPN1）的表達水平。結果 與對照組相比，F(xiàn)AC組細胞TfR1表達水平降低（t=2.695，P<0.05），F(xiàn)PN1表達水平無明顯變化（t=0.210，P>0.05）。結論 FAC可引起少突膠質細胞TfR1表達降低，而FPN1表達不變。

[關鍵詞]鐵;少突神經膠質;受體，轉鐵蛋白;轉鐵蛋白類

[中圖分類號]R338.2[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）03-0367-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.100

EFFECT OF FERRIC AMMONIUM CITRATE ON THE EXPRESSION OF IRON METABOLISM-RELATED PROTEINS IN OLIGODENDROCYTES

WANG Bingjing， ZHANG Huiqin， XIE Junxia， WANG Jun

（Department of Physiology， School of Basic Medicine， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of ferric ammonium citrate （FAC） on the expression of iron metabolism-related proteins in undifferentiated MO3.13 oligodendrocytes.?Methods MO3.13 cells were divided into control group and FAC group. The cells in the control group were treated with a cell culture medium， and those in the FAC group were treated with the cell culture medium containing 100 μmol/L FAC. After treatment for 24 hours， Western blotting was used to measure the expression levels of transferrin receptor 1 （TfR1） and ferroportin 1 （FPN1） in both groups.?Results Compared with the control group， the FAC group had a significant reduction in the expression level of TfR1 （t=2.695，P<0.05） and had no significant change in the expression of FPN1 （t=0.210，P>0.05）.?Conclusion FAC can reduce the expression of TfR1 in oligodendrocytes， while the expression of FPN1 remains unchanged.

[KEY WORDS] iron; oligodendroglia; receptors， transferrin; transferrins

帕金森?。≒D）被認為是世界上第二常見的神經退行性疾病，其主要病理特征是黑質致密部多巴胺能神經元的缺失[1]。近年來，隨著磁共振成像技術的進步，越來越多的證據表明，PD病人黑質中的鐵沉積增加[2-3]。鐵是一種過渡金屬，在生物圈中廣泛分布參與電子轉移的化學反應，對正常細胞功能至關重要。在鐵、亞鐵和三價鐵之間的氧化還原循環(huán)存在于生命所必需的各種反應中[4]。過量的鐵會產生有害的活性氧。在大腦中，鐵對于維持神經組織的高代謝和能量需求至關重要，并且還參與髓鞘合成、神經遞質合成和代謝[5-6]。生成髓鞘的少突膠質細胞維持著大腦中最高的鐵濃度[7-8]。少突膠質細胞中含有大量的鐵結合蛋白，如鐵蛋白和轉鐵蛋白[9]。已有實驗結果證明，在小膠質細胞內，高鐵引起二價金屬離子轉運蛋白1表達下調，鐵轉運蛋白1（FPN1）表達上調[10]。然而高鐵環(huán)境對少突膠質細胞內鐵代謝相關蛋白的影響目前仍不清楚。本實驗旨在探討枸櫞酸鐵銨（FAC）對MO3.13少突膠質細胞內鐵代謝相關蛋白表達的影響。

1材料和方法

1.1實驗材料

MO3.13少突膠質細胞購于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清購于以色列BI公司，胰酶購于美國Hyclone公司，F(xiàn)AC購于美國Sigma公司，轉鐵蛋白受體1（TfR1）抗體和FPN1抗體均購于Abcam公司，HRP-IgG標記的二抗購于Absin公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購于TherGmo公司，PVDF膜、ECL發(fā)光液均購于美國Millipore公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2實驗分組及處理

將未分化的MO3.13少突膠質細胞以6×10⁴/cm²密度接種于6孔板，每孔加入2 mL細胞混懸液培養(yǎng)。為了觀察鐵過載對TfR1和FPN1表達的影響，將細胞隨機分為對照組和FAC組。FAC組用加入100 μmol/L FAC的細胞培養(yǎng)液處理24 h，對照組用無血清細胞培養(yǎng)液處理。

1.3蛋白質免疫印跡實驗檢測TfR1和FPN1蛋白表達

藥物處理結束以后，收集6孔板內細胞蛋白，應用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，按照每孔總蛋白20 μg計算每個樣本的上樣量。蛋白經電泳（80 V、30 min和120 V、90 min）、轉膜（300 mA、90 min）后，用100 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，再分別加入FPN1（1∶1 000）、TfR1（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）抗體，4 ℃搖床上孵育過夜，然后用TBST溶液洗膜3次（每次10 min），加入山羊抗兔（1∶10 000）的HRP-IgG二抗室溫孵育1 h，再用TBST溶液洗膜3次（每次10 min），以ECL發(fā)光液顯影后用Image J軟件分析條帶灰度值。結果以TfR1和FPN1與β-actin的灰度值比值表示。實驗重復8次。

1.4統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學處理，結果以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

2結果

蛋白質免疫印跡實驗檢測結果顯示，F(xiàn)AC組細胞TfR1表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.695，P<0.05），而兩組細胞FPN1表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.210，P>0.05）。見表1。

3討論

許多神經退行性疾病的特點是中樞神經系統(tǒng)或周圍神經系統(tǒng)特定區(qū)域的局部鐵積累[11]。鐵的積累最終可能超過鐵的儲存能力，從而氧化還原活性鐵促進氧化應激[12]。細胞內鐵主要用于線粒體合成血紅素和鐵硫簇。鐵也參與DNA合成，核糖核苷酸還原酶是鐵依賴性酶，可在真核生物中催化脫氧核糖核苷酸的合成[13]。

少突膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的髓鞘形成細胞，除了維持髓鞘的功能外，該細胞還維持軸突的完整性，支持軸突代謝，幫助神經元存活[14-15]。神經元和膠質細胞在許多方面都需要鐵，包括電子傳遞、還原型輔酶Ⅱ活性的維持、軸突髓鞘形成以及作為參與神經遞質合成的幾種酶的輔助因子[16]。細胞內鐵含量主要取決于鐵吸收和釋放蛋白的表達，TfR1被認為是少突膠質細胞生存、生長和成熟的必要條件[17]。TfR1通過受體介導的內吞作用介導細胞對鐵的攝取，并在中樞神經系統(tǒng)的神經元和少突膠質細胞中高度表達[18]。少突膠質細胞和小膠質細胞通過FPN1途徑介導鐵外排[19]。參與腦細胞鐵輸出的蛋白質缺失或表達減少可能導致大腦中鐵的過度積累和神經退行性變，而FPN是哺乳動物中唯一已知的輸出細胞內鐵的蛋白質[20-21]。哺乳動物的鐵代謝受鐵調節(jié)蛋白（IRPs）的調節(jié)，IRPs表達降低，則TfR1表達降低，F(xiàn)PN1表達增加，反之亦然[22]。同時細胞FPN1的表達還受到鐵調素（hepcidin）的影響，hepcidin介導FPN1的細胞內吞，hepcidin表達增加，則FPN1表達降低[23]。Hepcidin的表達主要由鐵或炎癥刺激誘導，鐵的攝入刺激hepcidin表達防止高鐵血癥和進一步的膳食鐵吸收[24-25]。已有研究表明，在6-羥基多巴胺處理的小膠質細胞中，二價金屬離子轉運蛋白1和IRP1表達增加，hepcidin表達降低，F(xiàn)PN1表達無明顯變化，F(xiàn)PN1無明顯變化可能與IRP1表達增加和hepcidin表達降低有關[26]。而本實驗結果顯示，未分化的MO3.13少突膠質細胞用100 μmol/L FAC處理后TfR1蛋白表達下降，F(xiàn)PN1蛋白表達不變，F(xiàn)PN1蛋白表達不變可能與hepcidin表達增多和IRP1表達下降共同調節(jié)有關。

綜上所述，高鐵環(huán)境下少突膠質細胞內TfR1表達下降，F(xiàn)PN1表達不變，鐵轉入降低，鐵轉出不變，以防止細胞鐵聚集。本文結果為PD的治療提供了新的思路和靶點。

[參考文獻]

[1]HAN K， JIN X F， GUO X， et al. Nrf2 knockout altered brain iron deposition and mitigated age-related motor dysfunction in aging mice[J].? Free Radical Biology & Medicine， 2021，162：592-602.

[2]ZUCCA F A， SEGURA-AGUILAR J， FERRARI E， et al. Interactions of iron， dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinsons disease[J].? Progress in Neurobio-logy， 2017，155：96-119.

[3]WARD R J， ZUCCA F A， DUYN J H， et al. The role of iron in brain ageing and neurodegenerative disorders[J].? The Lancet Neurology， 2014，13（10）：1045-1060.

[4]GALARIS D， BARBOUTI A， PANTOPOULOS K. Iron homeostasis and oxidative stress： an intimate relationship[J].? Biochimica et Biophysica Acta Molecular Cell Research， 2019，1866（12）：118535.

[5]THIRUPATHI A， CHANG Y Z. Brain iron metabolism and CNS diseases[J].? Advances in Experimental Medicine and Biology， 2019，1173：1-19.

[6]M?LLER H E， BOSSONI L， CONNOR J R， et al. Iron， myelin， and the brain： neuroimaging meets neurobiology[J].? Trends in Neurosciences， 2019，42（6）：384-401.

[7]NOBUTA H， YANG N， NG Y H， et al. Oligodendrocyte death in pelizaeus-merzbacher disease is rescued by iron chelation[J].? Cell Stem Cell， 2019，25（4）：531-541.e6.

[8]BIRKL C， BIRKL-TOEGLHOFER A M， ENDMAYR V， et al. The influence of brain iron on myelin water imaging[J].? NeuroImage， 2019，199：545-552.

[9]MUKHERJEE C， KLING T， RUSSO B， et al. Oligodendrocytes provide antioxidant defense function for neurons by secreting ferritin heavy chain[J].? Cell Metabolism， 2020，32（2）：259-272.e10.

[10]孟大鵬，謝俊霞，王俊. 枸櫞酸鐵銨對BV2小膠質細胞DMT1和FPN1表達影響[J].? 青島大學醫(yī)學院學報， 2017，53（1）：12-13，17.

[11]MOCHIZUKI H， YASUDA T. Iron accumulation in Parkinsons disease[J].? Journal of Neural Transmission （Vienna， Austria：1996）， 2012，119（12）：1511-1514.

[12]DIXON S J， STOCKWELL B R. The role of iron and reactive oxygen species in cell death[J].? Nature Chemical Biology， 2014，10（1）：9-17.

[13]DE FREITAS J M， MENEGHINI R. Iron and its sensitive balance in the cell[J].? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis， 2001，475（1-2）：153-159.

[14]BANKSTON A N， MANDLER M D， FENG Y. Oligodendroglia and neurotrophic factors in neurodegeneration[J].? Neuroscience Bulletin， 2013，29（2）：216-228.

[15]FNFSCHILLING U， SUPPLIE L M， MAHAD D， et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity[J].? Nature， 2012，485（7399）：517-521.

[16]KE Y， QIAN Z M. Brain iron metabolism： neurobiology and neurochemistry[J].? Progress in Neurobiology， 2007，83（3）：149-173.

[17]JIANG D H， KE Y， CHENG Y Z， et al. Distribution of ferroportin1 protein in different regions of developing rat brain[J].? Developmental Neuroscience， 2002，24（2-3）：94-98.

[18]CONNOR J R， FINE R E. The distribution of transferrin immunoreactivity in the rat central nervous system[J].? Brain Research，1986，368（2）：319-328.

[19]QIAN Z M， KE Y. Brain iron transport[J].? Biological Reviews， 2019，94（5）：1672-1684.

[20]CHEN P H， WU J L， DING C C， et al. Kinome screen of ferroptosis reveals a novel role of ATM in regulating iron meta-bolism[J].? Cell Death and Differentiation， 2020，27（3）：1008-1022.

[21]MA X Y， DAS N K， CASTILLO C， et al. SMAD family member 3 （SMAD3） and SMAD4 repress HIF2α-dependent iron-regulatory genes[J].? The Journal of Biological Chemistry， 2019，294（11）：3974-3986.

[22]HUANG B W， MIYAZAWA M， TSUJI Y. Distinct regulatory mechanisms of the human ferritin gene by hypoxia and hypoxia mimetic cobalt chloride at the transcriptional and post-transcriptional levels[J].? Cellular Signalling， 2014，26（12）：2702-2709.

[23]HENTZE M W， MUCKENTHALER M U， GALY B， et al. Two to tango： regulation of Mammalian iron metabolism[J].? Cell， 2010，142（1）：24-38.

[24]WANG S M， FU L J， DUAN X L， et al. Role of hepcidin in murine brain iron metabolism[J].? Cellular and Molecular Life Sciences： CMLS， 2010，67（1）：123-133.

[25]DU F， QIAN C， QIAN Z M， et al. Hepcidin directly inhibits transferrin receptor 1 expression in astrocytes via a cyclic AMP-protein kinase A pathway[J].? Glia， 2011，59（6）：936-945.

[26]孟大鵬. 6-OHDA對BV2小膠質細胞鐵代謝的影響[D].? 青島：青島大學， 2017.

（本文編輯馬偉平）