miR-214-5p通過靶向調(diào)控PTEN的表達對破骨分化和骨質(zhì)疏松的影響

吳 鵬，姬振偉，王志學，馮重陽

骨質(zhì)疏松癥是一種慢性全身性骨骼代謝疾病，主要表現(xiàn)為骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化和破壞，骨脆性增加，易導致骨折。其病因是成骨細胞的活性小于破骨細胞，在老年和絕經(jīng)后的女性中更易發(fā)。骨質(zhì)疏松癥的防治一般包括促進骨礦化和骨形成，抑制骨吸收，但這些治療方法都存在一定不良反應(yīng)或并發(fā)癥。破骨細胞是一種源自單核細胞/巨噬細胞細胞譜系的多核細胞，在破骨細胞形成的過程中，許多轉(zhuǎn)錄因子正向或者負向調(diào)控破骨細胞的增殖和分化。miRNAs是一組約22個核苷酸的非編碼調(diào)控RNA分子，在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮多種調(diào)控功能。骨質(zhì)疏松是由于成骨細胞功能活性降低，破骨細胞功能活性升高，使骨形成和骨吸收失去平衡導致凈骨量丟失。miR-214-5p是一種高度保守的非編碼RNA，在骨肉瘤形成中發(fā)揮重要作用，抑制人骨肉瘤細胞的增殖和侵襲。第10號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten,PTEN)是一種不同尋常的磷酸酶，在胚胎發(fā)育過程中非常重要。相關(guān)研究表明，敲除PTEN促進了生長板軟骨細胞的分化，導致突變體顱骨厚度明顯增加。也有研究表明，PTEN在調(diào)節(jié)成骨細胞生命周期和揭示胚系PTEN基因突變所導致的骨骼發(fā)育異常中具有重要作用。目前，已有相關(guān)研究探討了關(guān)于miR-130a靶向調(diào)節(jié)PTEN基因?qū)θ巳橄侔┘毎嗳岜刃敲舾行缘挠绊?，但關(guān)于miR-214-5p通過PTEN的表達對破骨分化和骨質(zhì)疏松的影響的報道較少。本研究重點挖掘PTEN調(diào)控的上游分子，試圖描述miR-214-5p和PTEN在骨質(zhì)疏松癥中的調(diào)控作用，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的方向。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2019-03至2020-05在空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院外科進行脊柱手術(shù)且大于50歲的絕經(jīng)女性為研究對象，按照臨床骨質(zhì)疏松癥的診斷標準確診為骨質(zhì)疏松的患者20例作為骨質(zhì)疏松組，同時選取非骨質(zhì)疏松癥患者20例為對照組。骨質(zhì)疏松組平均(60.24±6.73)歲,對照組平均(61.59±5.81)歲,兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義。本研究通過倫理委員會審批，并經(jīng)過患者知情確認。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和破骨細胞分化 從中科院上海生命科學研究院細胞庫購買Raw264.7單核巨噬細胞，添加10%胎牛血清100 U/ml和青霉素100 mg/ml，加入50 μg/L的M-CSF、1α和100 μg/L的核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand ,RANKL), 置于37 ℃ 5% 的CO中培養(yǎng)，12 d后倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，直到成熟的破骨細胞形成。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組 經(jīng)RANKL誘導的破骨細胞以5×10/ml接種于6孔板中，添加DMEM培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)，24 h后，去除培養(yǎng)液，根據(jù)脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染使用說明進行轉(zhuǎn)染，將miR-214-5pmimics(miR-214-5pmimics組)、miR-214-5p空質(zhì)粒(miR-214-5pvector組)、shZFAS1載體(sh PTEN組)、shZFAS1空載體(shvector組)轉(zhuǎn)染細胞，對照組細胞不進行任何轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞采用1.2.1的方法進行實驗。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄熒光定量 PCR(reversetranscription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)檢測用注射器抽取術(shù)中患者骨髓血15 ml放入離心管中，加入Ficoll分離液，離心45 min，室溫1200 r/min,離心半徑9 cm，采用Ficoll液密度梯度離心法分離獲取骨髓單個核細胞，在采用RT-qPCR 檢測骨質(zhì)疏松患者和非骨質(zhì)疏松癥患者骨髓單個核細胞中的miR-214-5p和PTEN mRNA水平，同時檢測經(jīng)RANKL誘導的破骨細胞中NFaTc1、MMP9、TRAP、CTSK的mRNA水平，首先采用TRIZOL法從細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，利用miR-214-5p、PTEN和GAPDH引物在應(yīng)用生物系統(tǒng)7500實時PCR系統(tǒng)上進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)條件92 ℃，預變性30 min;72 ℃變性 50 s，60 ℃ 退火 20 s，52 ℃ 延伸15 s，共設(shè)置45個循環(huán)，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistnt acid phosphatase,TRAP) 細胞去掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入2.5%的戊二醛固定液固定10 min，預熱處理，在37 ℃孵育60 min，PBS沖洗，TRAP染色陽性顆粒為酒紅色，采用倒置相差顯微鏡觀察TRAP染色陽性顆粒的分布情況，并計算TRAP染色的陽性率。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western Blot) RIPA裂解緩沖液進行裂解，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移PVDF膜上。脫脂奶粉封閉膜30 min，在4 ℃孵育一抗PTEN、NFATc1、AKT和PI3K和GADPH，TBST洗滌，添加二抗室溫孵育60 min，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗 通過網(wǎng)址為http://www.targetscan.org/vert_71/ 的Targetscan網(wǎng)站預測miR-214-5p在PTEN mRNA的3′-UTR處的結(jié)合的位點。采用PCR技術(shù)從基因組擴增與miR-214-5p結(jié)合的PTEN-WT或者PTEN-MUT的3′-UTR序列，克隆到pGL-3熒光素酶報告載體中，將熒光素酶報告載體與miR-214-5p mimics和對照組共轉(zhuǎn)染到破骨細胞中，48 h后采用雙熒光素酶報告基因測試盒檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 miR-214-5p和PTEN的表達RT-qPCR 檢測骨質(zhì)疏松組和對照組骨髓單個核細胞中miR-214-5p和PTEN的表達，骨質(zhì)疏松組miR-214-5p水平的表達(2.96±0.32)高于對照組(0.78±0.06)，PTEN的表達(0.69±0.08)低于對照組(1.79±0.25)，差異均有統(tǒng)計學意義(<0.05)。

2.2 過表達miR-214-5p對破骨分化的影響 通過TRAP染色結(jié)果顯示，對照組、miR-214-5p vector組和miR-214-5p inhibitor組TRAP表達陽性率為(4.19±0.73)%、(4.62±0.72)%和(29.18±5.24)%，miR-214-5pinhibitor組破骨細胞較對照組和miR-214-5p vector組相比，體積形成較大，且miR-214-5p inhibitor組中TRAP表達陽性率明顯高于對照組和miR-214-5p vector組，差異有統(tǒng)計學意義(<0.001，圖1)。

圖1 過表達miR-214-5p對破骨分化的影響(TRAP，100×)

2.3 沉默PTENP對破骨分化的影響 通過TRAP染色結(jié)果顯示，對照組、sh vector組和sh PTEN組TRAP表達陽性率為(3.94±0.69)%、(4.02±0.70)%和(26.81±4.98)%，sh PTEN組破骨細胞較對照組和sh vector組體積形成較大較多，且sh PTEN組中TRAP表達陽性率明顯高于對照組和sh vector組(<0.001，圖2)。

圖2 沉默PTENP對破骨分化的影響(TRAP，100×)

2.4 過表達miR-214-5p對破骨分化相關(guān)基因的表達 RT-qPCR檢測破骨細胞相關(guān)基因的表達，結(jié)果顯示，對照組NFaTc1 、MMP9、TRAP和CTSK水平與miR-214-5p vector組比較，差異無統(tǒng)計學意義, miR-214-5p mimics組中的NFaTc1 、MMP9、TRAP和CTSK水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05，表1)。

表1 過表達miR-214-5p各組破骨分化相關(guān)基因的相對表達

2.5 沉默PTEN對破骨分化相關(guān)基因的表達 通過RT-qPCR法檢測破骨細胞相關(guān)基因的表達，對照組NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK水平與sh vector組比較，差異無統(tǒng)計學意義, sh PTEN組中的NFaTc1 、MMP9、TRAP和CTSK水平顯著高于對照組(<0.05，表2)。

表2 沉默PTEN各組破骨分化相關(guān)基因的相對表達

2.6 過表達miR-214-5p對破骨分化相關(guān)蛋白的表達 Western blot 檢測結(jié)果顯示，對照組NFATc1、AKT和PI3K蛋白表達與miR-214-5p vector組比較，差異無統(tǒng)計學意義，miR-214-5p mimics組NFATc1、AKT和PI3K蛋白表達明顯高于對照組(<0.05，圖3)。

圖3 過表達miR-214-5p對RAW 264.7細胞相關(guān)蛋白表達的影響

2.7 沉默PTEN對破骨分化相關(guān)蛋白的表達 Western blot 檢測結(jié)果顯示，對照組NFATc1、AKT和PI3K蛋白表達與sh vector組比較，差異無統(tǒng)計學意義，shPTEN組NFATc1、AKT和PI3K蛋白表達明顯高于對照組(<0.05，圖4)。

圖4 沉默PTENP過表達對RAW 264.7細胞相關(guān)蛋白表達的影響

2.8 miR-214-5p和PTEN靶向關(guān)系 通過TargetScan網(wǎng)站預測miR-214-5p潛在的靶基因，發(fā)現(xiàn)PTEN的3’-UTR區(qū)域與miR-214-5p具有靶向結(jié)合的位點。通過熒光素酶報告結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達miR-214-5p降低了PTEN-WT基因的熒光素酶活性(<0.05，圖5)，但是過表達miR-214-5p對PTEN-MUT的熒光素酶活性沒有變化(>0.05)。

圖5 雙熒光素酶報告基因驗證miR-214-5p與PTEN的生物信息學分析

2.9 過表達miR-214-5p表達對PTEN的影響 Western blot 檢測結(jié)果顯示，對照組PTEN蛋白表達與miR-214-5p vector組比較，差異無統(tǒng)計學意義，miR-214-5pmimics組的PTEN蛋白表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05，圖6)。

圖6 過表達miR-214-5p表達對PTEN的影響

2.10 過表達miR-214-5p抑制PTEN對破骨分化的影響 挽救實驗結(jié)果顯示，miR-214-5p空載組、miR-214-5p mimics組、miR-214-5p mimics+PTEN空載組、miR-214-5p mimics+PTEN組中TRAP表達陽性率分別為(3.87±0.65)%、(27.31±4.96)%、(28.62±5.03)%和(11.53±2.98)%，與miR-214-5p空載組相比，miR-214-5pmimics組、miR-214-5pmimics+PTEN空載組中TRAP表達陽性率明顯升高(<0.05)；miR-214-5p mimics組和miR-214-5pmimics+PTEN空載組中TRAP表達陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義；與miR-214-5p mimics組相比，miR-214-5pmimics+PTEN組中TRAP表達陽性率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(<0.05，圖7)。

圖7 過表達miR-214-5p抑制PTEN對破骨分化的影響(TRAP，100×)

3 討 論

破骨細胞黏附于骨基質(zhì),可以加快骨吸收，在骨質(zhì)疏松中起重要作用。骨髓中的單核/巨噬細胞是破骨細胞的前體細胞，與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生關(guān)系密切。相關(guān)研究表明，在巨噬細胞集落刺激因子與核因子κB受體活化素配體的相互作用，骨髓中的單核/巨噬細胞可以分化為破骨細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-214-5p和PTEN之間調(diào)控破骨細胞的體外分化，通過對骨質(zhì)疏松癥和非骨質(zhì)疏松癥患者骨髓單個核細胞miR-214-5p和PTEN表達的對比發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松組miR-214-5p水平的表達顯著上調(diào)， PTEN的表達顯著降低；同時miR-214-5p調(diào)控著PTEN的表達，過表達miR-214-5p會降低PTEN蛋白表達，miR-214-5p的表達與PTEN 水平的表達呈負相關(guān)性。

miRNAs是由大小15～22個核苷酸組成的單鏈小分子RNA，是按照堿基互補配對的方式與靶基因在3’-UTR以及編碼區(qū)的特定序列結(jié)合，抑制靶基因的翻譯和直接促進靶基因的mRNA的降解。miRNAs可以參與破骨細胞的成熟分化，對骨質(zhì)疏松癥具有巨大的治療潛力。研究報道，miR-34a靶向Tgif2抑制破骨細胞分化，防止骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移。也有研究證明，miR-214與PTEN在調(diào)控卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲方面存在負相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松組miR-214-5p顯著上調(diào)，PTEN顯著下降，并且miR-214-5p直接靶向PTEN調(diào)節(jié)RANKL誘導的巨噬細胞破骨細胞的形成。miR-214-5p過表達可誘導RAW 264.7細胞破骨細胞分化。文獻[15]報道，抑制miR-214-5p可以促進成骨細胞MC3T3-E1的分化，與本研究類似。

骨質(zhì)疏松癥已成為危害人類健康的比較嚴重的公共問題，骨質(zhì)疏松癥骨量的減少是由于破骨細胞導致的骨吸收增加或者成骨細胞引起的骨形成減少。長期平衡絕經(jīng)引起的骨形成和骨吸收是治療本病的主要出發(fā)點。目前臨床的主要治療手段是增加骨的吸收，但并未有報道闡明miR-214-5p和PTEN在調(diào)節(jié)破骨細胞功能中的作用。本研究證明了miR-214-5p和PTEN可能參與破骨細胞的分化。還能夠直接調(diào)控RAW 264.7細胞和相關(guān)基因和蛋白，NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK對破骨細胞生成過程至關(guān)重要，在這些信號途徑中，它們具有共同刺激免疫受體的RANKL，導致轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 的強烈誘導，在破骨細胞中起重要作用。NFATc1 是破骨細胞分化中的主要轉(zhuǎn)錄因子，過表達miR-214-5p或者沉默PTEN，NFATc1水平都會明顯上升。也就是說過表達miR-214-5p可能通過靶向PTEN抑制破骨細胞分化。

綜上所述，抑制miR-214-5p的表達可以上調(diào)PTEN水平，抑制破骨細胞分化，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的思路和方法。