雞滑液囊支原體貴州株的分離鑒定及VlhA基因序列分析

宋 春，王柏林，李 梅，文 明,2，王開功,2，陳常秀，程振濤,2

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴陽 550025；3.臨沂大學農林科學學院，臨沂 276005）

雞滑液囊支原體（Mycoplasmasynoviae，MS）對禽類產業危害嚴重，感染率呈現居高不下的趨勢[1-2]。雞滑液囊支原體病大多是慢性和持續性感染，主要影響關節滑膜囊、腱鞘和足墊腫脹，導致滲出性炎癥。此外,該病還會造成生長緩慢、飼料轉化率低、降低產蛋量和品質等[3-4]。該病可水平或垂直傳播，雞場一旦被感染，就很難徹底凈化[5]。MS與其他病原微生物混合感染會導致病情變得復雜嚴重，死亡率大大增加[6]。但目前并沒有針對MS的特效藥，唯一獲得生產許可的活疫苗MS-H株對已感染雞群沒有保護作用且會定植于呼吸道，破壞黏膜從而利于其他病原侵入感染[7-8]。近年來，中國很多地區不同品種雞群都存在MS感染[9-10]。丁美娟等[11]對江蘇省部分地區MS感染情況調查結果顯示，平均陽性率為57.7%，最高達82.4%，最低為38.9%。陳秀紅等[12]對寧夏5個地區雞場MS感染進行血清學調查結果顯示，各地區血清抗體陽性率為46.23%～89.67%，提示寧夏地區存在嚴重的MS感染。

雖然MS是單一血清型，但在菌株的毒力和致病性上表現出差異，部分菌株僅導致呼吸道的亞臨床感染，發病率低；但部分菌株可引起嚴重關節癥狀，發病率高，嚴重影響生產力[13-14]。鑒于此，對不同地區MS的分離顯得尤為重要。MS的VlhA基因編碼的血凝素蛋白是參與禽類支原體定植和毒力的最重要的表面蛋白之一，翻譯后被切割成脂蛋白（MSPB）和血凝素蛋白（MSPA），具有很強的抗原變異性[15]。VlhA基因主要通過表達和假基因轉換機制發生大小和階段變化，根據VlhA基因序列的變異程度可分為3個主要區域：保守區域、半可變區域和高度可變區域[16]。VlhA基因是近年來MS新型診斷方法和遺傳進化分析的熱點基因。李凡等[17]對從川西地區養雞場采樣分離的MS進行VlhA基因遺傳進化分析顯示，川西地區養雞場的MS感染率很高,且變異較大。貴州大學動物科學學院實驗室前期調查發現，貴州省已有不少養雞場存在MS感染[18]，但對MS貴州株的分離鑒定相關研究很少。本研究從貴州省某養雞場疑似MS感染病例中共采集107份樣品進行MS的分離培養及鑒定，以期了解貴州省MS流行株的生物特性及變異情況，為貴州省MS防控研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

MS標準株（GX11-T）購自中國獸醫藥品監察所；改良Frey氏培養基購自中海生物科技有限公司；葡萄糖、麥芽糖、尿素、精氨酸等生化試劑管均購自貴陽宏碩生物試劑公司；2×TaqPCR Mix、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、pMD19-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker購自Omega公司。

1.2 MS感染陽性樣本篩選

1.2.1 疑似MS感染病例臨床癥狀觀察 2019年9月中旬，貴州省織金縣某養殖場30日齡白羽肉雞出現關節、腳墊腫脹，不愿走動等疑似MS感染癥狀。抓取典型癥狀病雞，無菌采集咽喉拭子、腫脹關節、腳墊組織及腫脹組織滲出物。

1.2.2 MS陽性樣本篩選 基于MSVlhA基因（GenBank登錄號：AF085697.1）應用 Primer Premier 5.0軟件設計1對特異性檢測引物，引物序列為:MS-F1：5′-TCCAACAACAACGCAAAC-3′；MS-R1：5′-TAGGCATAAACCCGTCTC-3′，預期擴增片段大小為286 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取少量組織樣品研磨稀釋后離心過濾取濾液；滲出液稀釋、離心后取上清；咽拭子置于生理鹽水中震蕩混勻后取上清。參照DNA提取試劑盒說明書提取樣本總DNA并以此為模板進行PCR反應。PCR反應體系25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。取10 μL反應產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 MS陽性樣本的分離與鑒定

1.3.1 MS陽性樣本的分離培養及形態觀察 對PCR篩選出的陽性樣本進行MS分離培養。將少量陽性樣本組織研磨、稀釋（方法同1.2.2），取上清用改良Frey氏培養液于37 ℃恒溫箱中進行培養，顏色變橙黃時涂布于Frey氏平板繼續培養，有菌落生長時于倒置顯微鏡下觀察有無中央凸起呈“煎蛋狀”的典型支原體菌落，挑取單菌落到新培養液中培養至顏色變黃，離心后將沉淀物用瑞氏染色并于顯微鏡下觀察菌體形態。

1.3.2 分離株的生化鑒定試驗 參考丁美娟[19]方法，根據觀察的菌體及菌落，將可疑菌液接種于葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、精氨酸、尿素生化鑒定管，密封生化管后置于37 ℃恒溫箱培養，觀察顏色變化。

1.4 分離株VlhA基因PCR擴增及序列分析

提取疑似MS分離株的DNA，基于MSVlhA基因（GenBank登錄號：AF085697.1）設計引物擴增VlhA基因。引物序列為:MS-F2：5′-GCCATTGC-TCCTGCTGTTATA-3′；MS-R2：5′-GGGTAGT-CCACTCGCATT-3′，預期擴增片段大小為821 bp。 PCR反應體系50 μL：2×TaqPCR Mix 25 μL，DNA模板4 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2 μL，ddH2O 17 μL。 PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段進行膠回收后用pMD19-T載體克隆，篩選陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，再用MegAlign分析測序結果與GenBank中13株參考株VlhA基因序列的相似性，并構建遺傳進化樹。參考毒株信息見表1。

表1 參考菌株信息Table 1 Reference strains information

2 結 果

2.1 疑似MS感染病例臨床癥狀及剖檢病變

對疑似MS感染病雞進行臨床癥狀觀察，主要表現為關節腳墊腫脹、龍骨腫脹、站立不便等；對疑似MS感染雞進行剖檢病變觀察，病雞腫脹關節切開有半透明液體滲出、龍骨腫脹切開有黃色干奶酪樣滲出物，同時其他臟器病變不明顯。病雞呈MS感染典型癥狀。

2.2 MS陽性樣本篩選結果

107份樣本中初步篩選出20份MS陽性樣本，陽性率為18.7%，陽性樣本中腫脹關節5份，足墊6份，腫脹滲出物6份，咽拭子3份。部分擴增結果見圖1。

2.3 MS陽性樣本的分離培養及形態觀察結果

對陽性樣本進行培養，在Frey氏液體培養基中培養后液體變黃且清亮，在Frey氏固體平板上培養5 d后在顯微鏡下觀察到中間凸起的“煎蛋狀”菌落（圖2A）。 瑞氏染色疑似MS分離培養物可見細小的球形或橢圓形分離菌體（圖2B）。

圖2 分離菌株的菌落形態（A）和瑞氏染色（B,1 000×）觀察Fig.2 Observation of colony morphology （A） and Wright staining （B,1 000×） of the isolated strains

2.4 分離株生化鑒定結果

生化鑒定結果顯示，該疑似MS分離株能發酵葡萄糖和麥芽糖，不能發酵乳糖和蔗糖，不能分解尿素、甘露醇和精氨酸（表2）。

表2 疑似MS分離株生化試驗結果Table 2 Biochemical test results of suspected MS isolate

2.5 分離株VlhA基因PCR擴增結果

以提取的分離株DNA為模板,PCR擴增VlhA基因，得到目的條帶大小為821 bp（圖3），與預期相符，表明分離株為MS,命名為GZ-ZJ。

M,DL2000 DNA Marker；1，疑似MS樣本；2，陰性對照；3，陽性標準株M,DL2000 DNA Marker；1，Suspected MS sample；2，Negative control；3，Positive standard strain圖3 VlhA基因PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification result of VlhA gene

2.6 分離株VlhA基因核苷酸相似性分析

將測序正確的重組質粒VlhA基因序列與GenBank中13株參考株序列用MegAlign軟件進行相似性分析。由圖4可知，分離株GZ-ZJ與國內不同地區流行株VlhA基因相似性具有地域差異。分離株GZ-ZJ與安徽、湖南、湖北、江蘇、重慶、福建、廣東、廣西和云南等地區MS流行株VlhA基因的相似性在90.3%～99.7%之間。與湖南MS流行株相似性最高，達到99.7%。與斯洛文尼亞和突尼斯流行株相似性最低，為78.7%和87.3%，與雞毒支原體（Mycoplasmagallisepticum，MG）VlhA基因的相似性僅為27.9%，結果進一步表明該分離株為MS，且存在一定變異。

圖4 分離株VlhA基因核苷酸相似性分析Fig.4 Nucleotide similarity analysis of VlhA gene of the isolate

2.7 分離株VlhA基因遺傳進化樹分析

由圖5可知，該分離株GZ-ZJ與安徽、湖南、湖北、重慶、江蘇、福建、廣東、廣西和云南等地MS流行株VlhA基因處于同一大分支上，親緣關系很近；盡管和斯洛文尼亞的MS流行毒株屬于同一個分支，但親緣關系相對較遠；與MG則處于不同分支。表明該分離株是MS，而不是MG。

圖5 分離株VlhA基因遺傳進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of VlhA gene of the isolate

3 討 論

MS可引起雞關節、爪墊腫大及滑囊炎、腱鞘炎，使肉雞飼料轉化率低、生長受阻，蛋殼頂點異常綜合征[20]。近年來，貴州省大力發展林下養雞、茶園養雞等模式，不同雞群中出現疑似MS流行。MS的診斷方法主要包括病原的分離鑒定、血清學方法和分子生物學方法，但對于確診MS感染，分離鑒定是業內普遍認可的“金標準”[17]。MS臨床分離率普遍低，本研究對貴州省MS進行分離，但僅從腫大關節和足墊處分離到1株MS，低于徐引弟等[21]分離的25株MS，石曉磊[7]從腫脹的跗關節分離到13株MS。分析可能是雞場曾使用藥物治療導致組織中MS已被清除，且MS多呈慢性感染,組織中活菌數量較少導致PCR未檢測出來，此外混合感染的細菌、支原體等其他病原干擾MS生長也是分離率低的重要原因。對比前人研究[17，21-22]，在今后分離MS時應改進一些試驗方法，采取發病初期且未經治療的病雞腫大爪墊和關節病料，直接用Frey液體培養基培養，待培養液變黃再用含氨芐的Frey固體平板培養分離MS，可避免活菌數量少、PCR檢測不出來的情況，也可減少混合感染的部分病原對MS生長帶來的影響。同時檢測常與MS混合感染的大腸桿菌、雞毒支原體等病原，以排除其他病原的混合感染。雖然本次MS分離率低，但實際感染情況十分嚴重，對貴州省養雞業危害巨大，應當引起重視。

MS的血凝素蛋白VlhA基因保守的5′-端包括編碼脯氨酸重復序列的串聯重復序列和高度多態性區域（RⅢ），適合菌株分型，是MS遺傳進化分析的熱點靶基因[23-24]。本研究對MS分離菌VlhA基因保守片段進行核酸相似性和遺傳進化樹分析，結果顯示，該分離株VlhA基因與國內其他地區MS流行株VlhA基因處于同一大分支上，親緣關系很近，與湖南MS流行株KU572320.1相似性最高，達到99.7%；與國外斯洛文尼亞和突尼斯流行株親緣關系相對遠。說明貴州省織金縣肉雞場分離的MS存在一定的變異，且是由國內流行株變異而來。

動物回歸試驗是鑒定工作重要的一環。動物試驗可直接觀察到滑液囊支原體引起的臨床癥狀和病理變化，從攻毒試驗動物中重新分離到MS。但也受MS分離菌的毒力強弱或注入濃度、感染途徑差異等影響，其試驗動物的發病率和臨床病理變化也不同，從而影響鑒定工作的準確度[25-26]。本研究前期做動物回歸試驗，從足墊、氣管注射感染，但雞臨床癥狀不明顯，可能與MS分離株毒力有關，后期研究將增加菌株數量來逐步補充。

4 結 論

本研究分離到1株MS，在平板上生長出“煎蛋狀”菌落，能分解葡萄糖和麥芽糖，VlhA基因的序列分析顯示，該分離株與國內參考株相似性為90.3%～99.7%，表明該分離株存在一定變異。