頭孢氨芐免疫層析表面增強拉曼光譜檢測方法研究

陳 艷，薛 強，金 涌，鄒明強，齊小花，李博逸，殷 宏

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

頭孢氨芐（cephalexin）是一種β-內酰胺類抗生素，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抗菌作用，廣泛用于治療奶牛的乳腺炎等疾病[1]。但由于使用方法不當或不遵守休藥期等原因，易導致其在乳品中殘留，從而危害人體健康，且長時間超劑量使用會導致細菌的耐藥性[2]。針對該藥物在食品中的殘留，歐盟及中國均設定其在牛奶中的最高殘留限量為100 ng/mL[3-4]。

目前，用于檢測頭孢氨芐的方法主要有高效液相色譜法[5-6]或色譜-質譜聯用分析法[7]、熒光免疫層析法[8]、膠體金免疫層析法[9-10]等。 色譜法或色譜-質譜等聯用技術樣品前處理操作繁瑣、費用高，只有專業人員才能進行檢測，不適用于大量樣品的快速檢測。免疫分析法主要有膠體金層析法、熒光免疫層析法、ELISA方法等，此類方法檢測時間短，成本較低，適于現場監控和大規模樣品篩選，但在靈敏度、廣譜特異性或檢測范圍上會存在不足，檢測靈敏度亟需提高。 由于表面增強拉曼光譜技術（SERS）可檢測低至單分子水平的目標物，是目前最靈敏的分析方法之一[11-12]，將免疫層析和表面增強拉曼光譜相結合的技術，近幾年發展很快[13-14]。基于此，本研究制備了一種金銀復合核殼結構的納米貴金屬，通過連接頭孢氨芐抗體和拉曼信號分子，結合共聚焦拉曼光譜儀，開發快速、靈敏、操作簡便的牛奶中頭孢氨芐免疫層析表面增強拉曼光譜檢測方法，以期解決當前頭孢氨芐免疫檢測靈敏度低的瓶頸性技術難題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 頭孢氨芐標準品（cephalexin，CEX）、頭孢噻吩鈉標準品、頭孢曲松鈉標準品、頭孢克洛標準品、頭孢夫辛酯標準品均購自Dr.E公司；頭孢氨芐抗體（CEX-Ab）和頭孢氨芐包被原（CEX-BSA）均由本實驗室自制；NC膜（stedim UniSart CN140）購自Sartorius公司；樣品墊（GFCP20300）和吸水紙（CFSP223000）均購自Millpore公司；PVC底板購自上海金標生物科技有限公司；高氯酸（HAuCl4,99%）、檸檬酸三鈉（99.8%）、牛血清白蛋白（BSA,98%）和羊抗鼠IgG均購自Sigma公司；Tween-20購自北京化學試劑廠；5,5’-二硫代雙2-硝基苯甲酸 （5,5’-dithiobis-2-nitrob enzoic acid，DTNB）、Polyvinylpyrrolidone （PVP-K30，99%）、抗壞血酸（AA,99%）和硝酸銀（AgNO3,99%）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超純水（18.2 MΩ）購自Millpore公司。

1.1.2 主要儀器 共聚焦拉曼光譜儀（Renishaw invia）購自Renishaw公司；噴膜儀（Biodot XYZ 3050）和切條機（Biodot CM4000）均購自Biodot公司；微波合成萃取儀（XH-100A）購自北京祥鵠科技有限公司；透射電子顯微鏡（JEM-2100）購自JEOL公司；雙光束紫外分光光度計（U-3310）購自Hitachi Limited公司。

1.2 方法

1.2.1 納米金的制備 采用改良的檸檬酸三鈉還原法制備膠體金（AuNPs）[15]。將1%的氯金酸溶液1 mL加入99 mL去離子水中在微波合成萃取儀中加熱攪拌。溫度上升至98 ℃時，迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液1.4 mL，繼續加熱攪拌，顏色呈酒紅色后取出，冷卻至室溫。

1.2.2 金納米粒子表面修飾 DTNB 參考Ni等[16]方法，將AuNPs與拉曼信號分子DTNB連接。 取10 mL膠體金溶液加入0.01 mol/L的DTNB溶液20 μL，室溫下攪拌反應2 h，12 000 r/min 離心10 min，去除上清液，沉淀用2 mL超純水混懸，即得AuNPs-DTNB溶液。

1.2.3 銀包裹AuNPs-DTNB核殼結構的制備 取2 mL AuNPs-DTNB溶液和1 mL 1% PVP加入燒杯中室溫攪拌5 min，隨后加入2 mL 0.01 mol/L抗壞血酸并攪拌15 mim，在3種溶液混合的同時，逐滴加入0.01 mol/L AgNO3溶液0.6 mL，膠體顏色由酒紅變成橙黃，再攪拌反應30 min，用超純水洗滌2次，8 000 r/min離心10 min，沉淀用等體積的超純水混懸，超聲分散，即得金銀核殼與拉曼信號分子DTNB偶聯物（Au-DTNB@Ag），用透射電子顯微鏡和雙光束紫外分光光度計對納米金和修飾拉曼信號分子的金銀復合核殼結構進行表征。

1.2.4 拉曼免疫探針制備

1.2.4.1 K2CO3添加量優化 各取1 mL上述制備的Au-DTNB@Ag溶液，分別加入2、4、6、8和10 μL 0.05 mol/L的K2CO3溶液調pH，向溶液中加入4 μg CEX-Ab，攪拌反應30 min后，加入10% BSA溶液至終濃度為1%， 攪拌反應30 min。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，沉淀用保存液（即0.02 mol/L硼酸鈉緩沖液,含2% BSA,0.25% Proclin-300，pH 7.4）混懸。通過免疫層析試紙條層析，觀察檢測線（T線）和質控線（C線）的顏色，確定制備拉曼免疫探針加入最佳K2CO3的量。

1.2.4.2 抗體量優化 根據上述步驟確定的最佳K2CO3的量，各取1 mL Au-DTNB@Ag溶液，加入最佳K2CO3的量，調pH后，加入不同量的抗體（2、3、4和5 μg），攪拌反應30 min后，加入10% BSA溶液至終濃度為1%，攪拌反應30 min。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，沉淀用保存液混懸。通過免疫層析試紙條層析，觀察T線和C線的顏色，確定制備拉曼免疫探針的最佳抗體加入量。

1.2.5 基于SERS增強的免疫層析試紙條組裝 用0.02 mol/L PB稀釋CEX-BSA和羊抗鼠IgG，通過Biodot XYZ 3050噴膜儀噴膜，將包被原和羊抗鼠IgG包被在NC膜上，形成間隔0.4 cm的T線和C線，37 ℃恒溫恒濕烘箱烘2 h，干燥保存備用；樣品墊用0.01 mol/L Tris溶液（含0.5% Tween-20，pH 8.0）浸泡后于37 ℃烘干。將樣品墊、吸水墊分別粘貼在帶NC膜的PVC背襯上，用切條機切成4 mm寬的條狀，即制成試紙條，干燥保存備用。

1.2.6 SERS免疫層析試紙條檢測原理 樣品中的頭孢氨芐與T線上的包被抗原CEX-BSA競爭與拉曼免疫探針Au-DTNB@Ag-CEX Ab相結合。當樣品中有頭孢氨芐時，拉曼免疫探針上所連接的抗體與頭孢氨芐結合，CEX-BSA不能與拉曼免疫探針結合，因此，T線將不出現紅色條帶，結果為陽性。當樣品中沒有頭孢氨芐時，拉曼免疫探針在NC膜上層析后與T線上包被的CEX-BSA結合，T線出現紅色條帶，結果為陰性。通過共聚焦拉曼光譜儀測定T線上的探針信號，測定頭孢氨芐的含量（圖1）。

圖1 SERS免疫層析試紙條檢測原理Fig.1 Schematic principle of the SERS immunochromatographic strip

1.2.7 SERS免疫層析試紙條標準曲線的建立 取空白牛奶樣品，用3%的三氯乙酸按1∶1（V/V）處理，10 000 r/min離心15 min除去蛋白和脂肪，取中間層清液用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）5倍稀釋后，在稀釋液中添加不同濃度的頭孢氨芐標準品，終濃度分別為0、0.01、0.1、0.5和1 ng/mL。在96微孔板里滴加5 μL的Au-DTNB@Ag-CEX Ab，分別取100 μL上述溶液加入微孔板里混勻，插入頭孢氨芐SERS的免疫層析試紙條，頭孢氨芐奶樣溶液連同Au-DTNB@Ag-CEX Ab由于毛細管作用在NC膜表面層析，NC膜上的T線和C線即會顯色，通過共聚焦拉曼光譜儀檢測T線拉曼信號分子DTNB的特征峰。以相對拉曼光強度為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制頭孢氨芐的標準抑制曲線。該方法的最低檢測限為空白測定平均值加3倍標準偏差。

1.2.9 牛奶添加回收 在空白牛奶樣品中添加頭孢氨芐標準品至終濃度分別為1、4和8 ng/mL。將牛奶和3%的三氯乙酸按1∶1（V/V）混合，4 ℃、10 000 r/min離心15 min后，除去蛋白和脂肪，中間層清液轉移到干凈的離心管中，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4） 5倍稀釋，取100 μL用頭孢氨芐SERS免疫層析試紙條層析，然后用共聚焦拉曼光譜儀測定DTNB信號分子的特征峰。

2 結 果

2.1 納米金和修飾DTNB的金銀復合核殼的表征

透射電子顯微鏡結果顯示，納米金粒子的尺寸為20 nm左右，金銀復合核殼尺寸約30 nm，且粒子中心為黑色；紫外分光光度計掃描納米金的最大吸收波長在520 nm附近，而金銀復合核殼的最大吸收波長出現在420 nm附近，發生了遷移，說明銀成功包裹在金表面。用共聚焦拉曼光譜儀檢測納米金和修飾DTNB的金銀復合核殼，發現修飾DTNB的金銀復合核殼出現拉曼信號，而未修飾DTNB的納米金無拉曼信號（圖2）。

A,納米金透射電子顯微鏡觀察（320 000×）；B,修飾DTNB的金銀復合核殼透射電子顯微鏡觀察（650 000×）；C,納米金和修飾DTNB的金銀復合核殼的紫外吸收光譜；D,納米金和修飾DTNB金銀復合核殼拉曼光譜A,TEM of AuNPs （320 000×）；B,TEM of Au-DTNB@Ag （650 000×）；C,Ultraviolet absorption spectra of AuNPs and Au-DTNB@Ag；D,Raman spectroscopy of AuNPs and Au-DTNB@Ag圖2 納米金和修飾DTNB的金銀復合核殼的表征Fig.2 Characterization of AuNPs and Au-DTNB@Ag

2.2 拉曼免疫探針最佳K2CO3和最佳抗體量的優化

由圖3A可知，隨著K2CO3量的增加，層析試紙條上T、C線顯色逐漸變深，當K2CO3加入量為6 μL時，層析試紙條上T、C線顯色最深，再繼續增加K2CO3的量，T、C線顯色變淺，因此，最適的K2CO3使用量為6 μL。由圖3B可知，隨著頭孢氨芐抗體量的增加，層析試紙條上T、C線顯色逐漸變深，再繼續增加抗體量，抗體結合逐漸飽和，T、C線顯色不變，因此最適的抗體使用量為3 μg。

A,K2CO3添加的優化；B,抗體標記量的優化A,Optimization of K2CO3 addtion；B,Optimization of antibody labeling quantity圖3 拉曼免疫探針制備反應條件的優化Fig.3 Optimization of reaction conditions for preparation of Raman immunoprobe

2.3 頭孢氨芐標準曲線的建立

通過共聚焦拉曼光譜儀測定SERS免疫層析試紙條T線上的拉曼探針DTNB的拉曼光譜，DTNB的特征峰為1 062、1 154、1 334和1 558 cm-1，在1 334 cm-1處特征峰信號最強，選取此處峰高進行定量測定頭孢氨芐的含量。以相對拉曼光強度為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制頭孢氨芐的標準抑制曲線（圖4）。由圖4A可知，隨著牛奶樣品中頭孢氨芐含量的增加，檢測線T線顏色逐漸變淺，肉眼觀察頭孢氨芐免疫層析試紙條的檢測限為1 ng/mL，頭孢氨芐的標準抑制曲線回歸方程為y=-11 177.86 lg（x）+6 208.29，相關系數R2=0.98。根據空白測定平均值加3倍標準偏差，求得最低檢測限為0.001 ng/mL,線性范圍為0～1 ng/mL，50%抑制的質量濃度為0.05 ng/mL。

A,頭孢氨芐SERS免疫層析試紙條；B,頭孢氨芐SERS增強拉曼光譜圖；C,頭孢氨芐標準曲線A,Cephalexin SERS immunochromatographic strip；B,SERS enhanced Raman spectrogram of cephalexin；C,Standard curve of cephalexin圖4 頭孢氨芐標準曲線的建立Fig.4 Establishment of standard curve of cephalexin

2.4 交叉反應率

采用SERS的免疫層析試紙條對結構類似的頭孢菌素類藥物進行交叉反應性試驗，結果顯示，該試紙條與頭孢克洛有交叉反應性，頭孢克洛50%抑制濃度為0.045 ng/mL， 交叉反應率為111.1%；與其他頭孢菌素類藥物無交叉反應性，交叉反應率均低于0.1%（表1）。表明本試驗所建立的頭孢氨芐SERS免疫層析檢測方法對頭孢氨芐和頭孢克洛具有較高的特異性。

表1 頭孢氨芐SERS免疫層析試紙條交叉反應性Table 1 Cross reactivity of cephalexin SERS immunochromatographic strips

2.5 牛奶添加回收

由表2可知，頭孢氨芐的加標回收率范圍為94.4%～103.3%，變異系數為2.5%～7.4%。這表明本試驗建立的方法對于牛奶樣品中頭孢氨芐殘留的檢測有很好的適用性和準確度。

表2 SERS免疫層析試紙條測定牛奶加標回收率（n=4）Table 2 Determination of spiked milk recovery by SERS immunochromatographic strip （n=4）

3 討 論

早在1989年，Rohr等[17]研究發現，將固相抗體和拉曼增強試劑標記過的抗體通過目標物相連，形成“三明治”夾心復合物，通過測定標記抗體的SERS信號進行目標物的檢測。隨著研究的不斷深入，表面增強拉曼光譜結合免疫分析技術進入了快速發展時期，近幾年發展成為分析化學領域的研究熱點之一。

將表面增強拉曼光譜與免疫分析技術進行結合建立的SERS免疫層析檢測技術，不僅具有SERS的高靈敏性和光譜可區分性，還具有免疫分析的高特異性和便捷性[18-20]。表面增強拉曼光譜免疫分析技術的關鍵點是拉曼免疫探針的制備，這就需要進行探針材料和拉曼信號分子的選擇。Wang等[21]利用銀包裹金核殼作為拉曼探針材料，修飾拉曼信號分子4-巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，MBA）和雙酚A抗體，合成拉曼免疫探針，開發了水中雙酚A的檢測方法。Shi等[22]利用金納米粒子作為探針材料，選用同一種拉曼信號分子4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol，PATP），分別與新霉素抗體和喹諾酮類抗體結合，合成新霉素拉曼免疫探針和喹諾酮類拉曼免疫探針，開發了牛奶種同時檢測2種抗菌藥的方法。Wang等[23]利用銀包裹金作為探針材料，修飾拉曼信號分子4-硝基苯硫酚（4-nitrothiophenol，4-NTP）和葡萄球菌腸毒素B抗體，合成拉曼免疫探針，開發了牛奶中檢測葡萄球菌腸毒素B的方法。Wang等[24]利用二氧化硅包裹金核殼作為探針材料，修飾拉曼信號分子DTNB和白細胞介素6（IL-6）抗體，合成拉曼免疫探針，開發了檢測全血中的IL-6的高靈敏檢測方法。 綜上所述，拉曼探針材料和拉曼信號分子的選擇具有多樣性，若同時進行多個目標物的檢測可選擇多種拉曼信號分子合成多種拉曼免疫探針，也可通過試紙條包被多個目標物來實現多殘留檢測。這種表面增強拉曼光譜與免疫分析技術相結合的技術極大地提高了待測目標物的靈敏度，且具有較強的特異性，多目標物同時檢測不但節省了時間，還降低了檢測的成本。

本研究選擇制作簡便、成本低的金、銀2種貴金屬作為拉曼探針材料，拉曼信號分子選擇DTNB。利用銀包裹金核殼結構作為SERS探針材料，既具有金納米粒子的穩定性，又具有銀納米粒子的拉曼增強效果。 在金銀核殼表面修飾拉曼信號分子DTNB和頭孢氨芐抗體，將表面增強拉曼光譜技術與免疫層析技術相結合，開發了一種超靈敏的頭孢氨芐表面增強拉曼光譜免疫層析檢測技術，這種方法的線性檢測范圍為0～1 ng/mL，檢測限為0.001 ng/mL。胡佳麗等[25]建立熒光免疫層析法快速測定牛奶中頭孢氨芐殘留量，檢測限為0.16 ng/mL。 Bian等[26]制備了頭孢氨芐單克隆抗體，建立了牛奶等樣品中頭孢氨芐免疫熒光檢測方法的檢測限為0.1 ng/mL。Li等[27]結合免疫磁珠分離技術建立的頭孢氨芐熒光檢測技術的檢測限為0.34 ng/mL。本研究獲得頭孢氨芐的檢測限為0.001 ng/mL，具有更高的靈敏度。

樣品基質里含有的蛋白質和脂肪會影響免疫分析試驗中抗原-抗體的結合，會降低免疫競爭反應的敏感性和可靠性。因此，可通過對樣品進行適當稀釋或適當的凈化步驟消除基質干擾。本試驗繪制的標準曲線是將藥物加入牛奶中，再用3%的三氯乙酸處理，離心去除蛋白和脂肪，最后用PBS稀釋5倍，基本消除基質的干擾，樣品測定也以相同的反應介質，這樣能減少基質干擾帶來的試驗誤差，對于牛奶樣品僅需簡單的前處理去除蛋白和脂肪即可用于檢測。

4 結 論

本研究制備了一種金銀復合核殼結構的納米貴金屬拉曼探針，開發了一種快速高靈敏檢測牛奶中頭孢氨芐殘留的SERS免疫層析檢測方法，檢測限為0.01 ng/mL,具有快速、便攜、操作方便等膠體金試紙條的優點，并且利用表面拉曼增強技術提高了其檢測靈敏度。