原兒茶酸對LPS誘導的小鼠子宮內膜炎的作用機制研究

張玉珠，于 超，鄭慧華，唐欣悅，黃榮磊，謝光洪

（吉林大學動物醫學學院,長春 130062）

子宮內膜炎是一種感染性和炎癥性的子宮內膜疾病，嚴重危害著人類和動物的生殖系統[1]。研究表明，在小動物臨床中約25%未絕育的母犬在10歲前會發生子宮疾病（子宮內膜炎、子宮蓄膿等）[2]，而大腸桿菌被認為是引發子宮內膜炎的最重要因素[3]。如果不治療，母犬可能會發展為內毒素血癥、敗血癥或敗血性休克，從而危機生命[4]。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外壁的主要組成成分，一旦進入機體，對機體產生刺激，便會激活機體中宿主細胞細胞膜表面的Toll樣受體4（TLR4）信號通路，隨后導致其下游介質中核因子-κB（NF-κB）的激活,會釋放炎性細胞因子（如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等），從而導致機體損傷[5]，也會導致細胞質中的NF-κB抑制劑（IκB）蛋白與p65從失活狀態發生磷酸化（p-p65和p-IκB），從而啟動炎性細胞因子轉錄，誘發炎癥反應[6]。髓過氧化物酶（MPO）是一種血紅素蛋白，是中性粒細胞的主要組成成分，MPO活性越高，說明炎癥反應越強烈[7]。上述指標均可用于判斷LPS誘導建立的小鼠子宮內膜炎模型是否成功。研究表明，抑制NF-κB信號通路對子宮內膜炎具有保護作用[8]。因此，尋找一種能夠抑制NF-κB信號通路的藥物對子宮內膜炎的治療是非常重要的。

目前，對子宮內膜炎的治療主要依賴抗生素，但抗生素的使用導致耐藥性和藥物殘留增加，已成為小動物臨床和養殖業的一大隱患[9]。因此，亟待尋找一種治療子宮內膜炎的新方法。近年來，中藥因其安全性好、毒副作用少、無殘留等優點在臨床用藥中越來越受重視，在輔助治療炎癥性疾病方面也越來越受重視，因此中藥及其活性成分的研究與開發也成為了人們關注的熱點。原兒茶酸是花青素的酚類化合物，存在于水稻、洋蔥、迷迭香、肉桂、芙蓉、丹參等中[10]，具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗氧化等[11]。研究表明，原兒茶酸可改善LPS刺激引起的仔豬腸道炎癥反應[12]；可通過調節NF-κB通路抑制LPS激活的BV2小膠質細胞炎癥反應[13]；還可以通過調節HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抑制急性胰腺炎的炎癥反應[14]，然而原兒茶酸對子宮內膜炎是否具有抑制炎癥反應尚不清楚。本試驗利用LPS建立小鼠子宮內膜炎模型，通過檢測子宮組織的病理變化、MPO活性、炎性因子含量以及NF-κB信號通路相關蛋白來探討原兒茶酸對LPS誘導的小鼠子宮內膜炎的作用機制，以期為將原兒茶酸用于臨床上治療炎癥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及其飼養管理

60只健康BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術股份有限責任公司，雌性，6～8周齡，體重18～22 g，于室溫（24±1）℃、相對濕度55%、12 h循環光照適應1周，將小鼠隨機分為5籠，每籠各12只，飼喂常規飼糧，自由進食和飲水。

1.2 主要試劑

原兒茶酸（純度>98%）購自成都優選生物技術有限公司；LPS購自Sigma公司；MPO測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒均購自Biolegend公司；抗NF-κB p65和IκB抗體均購自Danvers公司；Anti-mouse和Anti-rabbit二抗均購自CST公司；胎牛血清購自CLARK公司；ECL化學發光試劑和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自Thermo公司；PBS緩沖液購自Solarbio公司。

原兒茶酸配制：稱取40 mg原兒茶酸溶于1 mL DMSO中配成40 mg/mL溶液，待藥物完全溶解后，分裝到EP管中于-20 ℃保存待用。根據小鼠具體體重和不同濃度原兒茶酸（20、40、80 mg/kg）組計算所需劑量，然后用生理鹽水稀釋到400 μL。

LPS配制：以PBS溶解，配成10 mg/mL，-20 ℃保存，使用時室溫解凍后，稀釋10倍配成濃度為1 mg/mL的LPS溶液。

1.3 試驗動物分組及處理

60只小鼠隨機分為對照組、LPS組、LPS+不同濃度原兒茶酸（20、40、80 mg/kg）組共5組，每組各12只。 對照組小鼠用微量注射器經陰道灌注50 μL生理鹽水，LPS組灌注50 μL LPS（1 mg/mL，溶解于無菌PBS中）[8]， 原兒茶酸治療組灌注50 μL LPS前1 h分別腹腔注射20、40、80 mg/kg原兒茶酸，注射24 h后，頸椎脫臼法處死所有小鼠，收集子宮組織，一部分用10%福爾馬林固定，一部分于-80 ℃保存待測。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 組織病理變化檢測 子宮組織在10%福爾馬林中固定24 h以上，經過脫水、組織透明后在石蠟液中浸蠟，制成石蠟組織塊，并用切片機切成5 μm切片。將切片附在載玻片上，烘干。經過脫蠟、沖洗、HE染色后再脫水，透明后封片，鏡檢觀察，采集圖像。

1.4.2 MPO活性檢測 取小鼠子宮組織，加入PBS于冰上進行稱量和研磨，然后按照MPO檢測試劑盒說明書檢測子宮組織的MPO活性，用分光光度計測定D460 nm值。

1.4.3 炎性因子檢測 采用ELISA法按照TNF-α、IL-6和IL-1β試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定D450 nm值，計算子宮組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.4.4 NF-κB信號通路相關蛋白檢測 稱取小鼠子宮組織，與PBS溶液按重量體積比為1∶9加入勻漿器中研磨，將勻漿液收集至EP管中，采用BCA法測定蛋白的濃度。通過SDS-PAGE進行分離后，利用濕轉法將這些蛋白轉移到PVDF膜上，用3%胎牛血清室溫封閉3 h，與一抗（1∶1 000） 4 ℃孵育過夜，二抗（1∶20 000）室溫孵育2 h。將PVDF膜置于化學發光成像系統，滴加ECL化學發光液進行顯像，采集圖像。用ImageJ 1.48軟件進行灰度分析。

1.5 數據統計分析

用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 原兒茶酸對LPS誘導小鼠子宮組織的影響

由圖1可知，對照組（圖1A）小鼠子宮組織形態正常，子宮內膜上皮結構正常；LPS組小鼠子宮組織出現嚴重的炎性細胞浸潤和子宮內膜上皮充血及水腫（圖1B）。與LPS組相比，隨著原兒茶酸濃度的增加，小鼠子宮組織中炎性細胞明顯減少，子宮內膜上皮充血水腫情況也明顯得到改善（圖1C～1E）。

A，對照組；B，LPS組；C，LPS+20 mg/kg原兒茶酸組；D，LPS+40 mg/kg原兒茶酸組；E，LPS+80 mg/kg原兒茶酸組A,Control group;B,LPS group;C,LPS+20 mg/kg protocatechuic acid group;D,LPS+40 mg/kg protocatechuic acid group;E,LPS+80 mg/kg protocatechuic acid group圖1 各組小鼠子宮組織病理變化（100×）Fig.1 Pathological changes of mouse uterus tissues in each group （100×）

2.2 原兒茶酸對LPS誘導小鼠子宮組織MPO活性的影響

由圖2可知，與對照組相比，LPS組MPO活性極顯著升高（P<0.01）；與LPS組相比，原兒茶酸治療組MPO活性均極顯著降低（P<0.01），并呈劑量依賴性。結合病理檢測中對照組和LPS組病理變化，說明LPS誘導的小鼠子宮內膜炎模型構建成功。

①1～5，分別代表對照組、LPS組、LPS+20 mg/kg原兒茶酸組、LPS+40 mg/kg原兒茶酸組、LPS+80 mg/kg原兒茶酸組。②與對照組相比，#，差異極顯著（P<0.01）。③與LPS組相比，*，差異顯著（P<0.05）；**，差異極顯著（P<0.01）。下同①1-5,Control group,LPS group,LPS+20 mg/kg protocatechuic acid group,LPS+40 mg/kg protocatechuic acid group,LPS+80 mg/kg protocatechuic acid group,respectively.②Compared with control group,#，Extremely significant difference （P<0.01）.③Compared with LPS group,*,Significant difference （P<0.05）,**,Extremely significant difference （P<0.01）.The same as below圖2 各組小鼠子宮組織MPO活性Fig.2 MPO activity of mouse uterus tissues in each group

2.3 原兒茶酸對LPS誘導小鼠子宮組織炎性因子的影響

由圖3可知，與對照組相比，LPS組小鼠子宮內膜組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均極顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，原兒茶酸治療組小鼠子宮內膜組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均極顯著降低（P<0.01），并呈劑量依賴性。

圖3 各組小鼠子宮組織中炎性細胞因子含量Fig.3 Contents of inflammatory cytokine in uterine tissues of mice in each group

2.4 原兒茶酸對LPS誘導小鼠子宮組織NF-κB信號通路的影響

由圖4可知，與對照組相比，LPS組p-p65和p-IκB蛋白的表達水平均極顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，原兒茶酸治療組p-p65和p-IκB的表達水平均極顯著降低（P<0.01），且呈劑量依賴性。

圖4 各組小鼠子宮組織NF-κB信號通路相關蛋白的表達Fig.4 Expressions of NF-κB signaling pathway related protein in uterine tissues of mice in each group

3 討 論

子宮內膜炎是指子宮黏膜發生細菌感染而致的炎癥，是導致動物不孕的重要原因之一[15]。在小動物臨床，常發生于未絕育成年母犬，病原微生物感染被認為是主要的發病原因[16]。而LPS是革蘭氏陰性菌外壁的主要組成成分，廣泛用于炎癥相關領域研究，如急性肺炎[17]、急性肝炎[18]、心肌炎[19]等。原兒茶酸是花青素的主要生物活性代謝產物，存在于杜仲、高寒和冬青等植物體內，且具有抗氧化[20]、抗炎作用[21]。本研究中，LPS作用于小鼠子宮引發子宮內膜發生炎性反應，導致子宮內膜發生嚴重的病理改變，如嚴重的炎性細胞浸潤和子宮內膜上皮充血且水腫。而原兒茶酸的治療組炎性細胞浸潤減少，子宮內膜的充血、水腫減輕，這說明原兒茶酸可以有效改善小鼠子宮內膜炎的病理損傷。MPO是中性粒細胞富含的蛋白質[7]，其活性越高，說明炎癥反應越劇烈。本試驗研究結果表明，與對照組相比，LPS誘導的小鼠子宮內膜組織中中性粒細胞增多且MPO活性增高，而經原兒茶酸治療后MPO活性顯著降低，說明原兒茶酸對LPS誘導的子宮內膜炎能起到保護作用，降低炎性反應，減少中性粒細胞的浸潤，且隨著濃度的增高，效果更加顯著。

炎癥是機體對于刺激的一種防御反應，而過度的炎癥反應會導致機體發病。研究表明，許多炎癥細胞因子的產生與疾病發生過程中的炎癥有關，而炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6在子宮內膜炎的發生中發揮了重要作用[22]，這些炎癥因子會對子宮和子宮組織造成損傷。本試驗結果表明，LPS可誘導炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，而原兒茶酸可顯著降低LPS誘導的小鼠子宮內膜組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，表明原兒茶酸可通過抑制促炎細胞因子的產生發揮抗炎作用。因此，抑制炎癥細胞因子的產生可能是治療子宮內膜炎的一個靶點。NF-κB是脊椎動物的一個主要的轉錄因子，在炎癥、免疫、細胞增殖和凋亡中發揮重要作用[23]。當機體炎癥升高，會刺激NF-κB信號通路活化，從而導致IκB和p65磷酸化表達增加[6]。本試驗結果表明，LPS處理的小鼠子宮內膜中p-p65和p-IκB的表達水平均極顯著增加，原兒茶酸治療極顯著降低了p-p65和p-IκB的表達，從而抑制NF-κB的活性。因此，原兒茶酸能夠抑制LPS誘導小鼠子宮內膜炎中NF-κB信號通路的激活，從而對小鼠子宮內膜炎起到保護作用。

4 結 論

本研究結果表明，原兒茶酸可通過減少LPS處理的小鼠子宮組織中的炎性細胞，減輕子宮內膜的充血、水腫，降低子宮組織MPO活性，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的產生及NF-κB信號通路的激活，從而對LPS誘導的小鼠子宮內膜炎起到保護作用。