植物乳桿菌CY1-2 對粉紅單端孢體外和番茄體內的抑菌活性及可能機制研究

張晨陽，侯佳寶，程 園，李燦嬰,2，葛永紅,2,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2.生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是重要的采后致腐真菌之一，會導致鱷梨[1]、芒果[2]、甜瓜[3-4]、蘋果[5]、葡萄[6]、番茄[7]、黃瓜[8]等果蔬的采后腐爛。該病原菌不僅由果實表面的傷口侵染進入體內而引起果實腐爛，而且還會在寄主體內產生具有致癌作用的單端孢霉烯毒素[5]。生產中主要應用人工合成的殺菌劑控制由T.roseum 引起的病害，但存在殘留、環境污染、誘導病原物產生抗藥性等問題[9]。研究表明，離體條件下，核黃素、ε-聚賴氨酸、硝普鈉、磷酸鈉對T.roseum的菌絲生長和孢子萌發有顯著抑制效果[10-13]。此外，香菜精油對T. roseum 菌絲生長也有明顯的抑制效果[14]。體內試驗表明，采后使用苯并噻重氮、康壯素、硅酸鈉、草酸、硫胺素進行處理，能夠抑制甜瓜果實由T.roseum 引起的粉霉病[15-18]。

利用拮抗菌控制采后病害是果蔬病害防治的新方法之一，其以微生物之間的寄生、拮抗作用為理論基礎[19]。乳酸菌是一類無芽孢的革蘭氏陽性細菌，具有廣譜抑菌特性，廣泛應用于食品行業[20]。研究發現，植物乳桿菌LH-B02、NR115605.1、IMAU10014 可以改善蓮藕的貯藏性能，抑制采后木瓜、芒果和卷心菜等果蔬的炭疽病[21-23]。Fang 等[24]研究發現，保加利亞乳桿菌F17 對葡萄灰霉病具有良好的抑制作用，并能延緩葡萄的成熟和衰老。此外，植物乳桿菌PTCC1058結合羧甲基纖維素能夠抑制草莓果實表面酵母和霉菌的生長[25]。Lü 等[26]報道，植物乳桿菌C10 顯著抑制了T.roseum 的生長，并且嚴重破壞了T.roseum 的孢子結構。然而，尚未見植物乳桿菌CY1-2 對番茄紅粉病的控制及其抑菌機理的研究報道。

本文以T.roseum 為對象，研究植物乳桿菌CY1-2（Lactobacillus plantarum CY1-2）在體內和體外條件下對T.roseum 生長的影響，并初步探討了L.plantarum CY1-2 抑制T.roseum 生長的機制，以期為開發新的生物防腐保鮮劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

粉紅單端孢：渤海大學食品科學與工程學院采后試驗室保存菌種，使用前用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基以24 ℃活化培養5～7 d；植物乳桿菌CY1-2：渤海大學食品科學與工程學院微生物課題組提供，分離自朝陽傳統發酵酸菜，使用前在莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良乳酸菌（MRS）液體培養基中37 ℃培養24 h；番茄果實，購買自錦州市當地批發市場。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，上海廣銳生物科技有限公司；MRS 液體培養基，北京奧博星生物技術有限公司；乙酸乙酯、蒽酮，山東西亞化學工業有限公司；考馬斯亮藍G-250，北京瑞爾欣德科技有限公司；2-硫代巴比妥酸（TBA），上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

UV-2250 紫外可見分光光度計，山東奧秘科技有限公司；JEM-1230 型透射式電子顯微鏡，美國GATAN 公司；H1650 臺式高速冷凍離心機，上海滬粵明科學儀器有限公司；HZQ/THZ 恒溫振蕩器、HZQ-X300C 恒溫振蕩培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；DDSJ-308A 電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；Accuri C6 流式細胞儀，美國BD 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液制備

參照Ge 等[27]的方法。將培養7 d 的T.roseum PDA平板用5～10 mL 無菌蒸餾水清洗，經無菌紗布過濾后配制成濃度為1.0×106CFU/mL 的孢子懸浮液。

1.2.2 不同濃度L.plantarum CY1-2 對T.roseum 孢子萌發和菌絲生長的影響

參照Ge 等[28]的試驗方法并修改。在分別含有0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL L. plantarum CY1-2 的PDA 平板中央放置培養5 d 的T. roseum 菌餅（直徑5 mm），26 ℃恒溫培養，從第4 天開始每2 d 測量菌落直徑，直至對照菌絲長至邊緣。每個濃度制作10 個平板，重復3 次。

將制備的1.0×106CFU/mL 的T.roseum 孢子懸浮液分別與含有0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL 的L. plantarum CY1-2 等體積混合，然后分別向PDA 平板中接入100 μL 混合液，用涂布棒涂抹均勻后于26 ℃恒溫培養。從接種后14 h 開始每2 h 在電子顯微鏡下觀察孢子萌發狀態，每個濃度每次統計300 個孢子。對照組（未添加L.plantarum CY1-2）孢子萌發率大于80%時停止觀察計數。

1.2.3 番茄果實損傷接種

參照Ge 等[29]的方法并作修改。番茄果實用75%乙醇進行表面消毒，然后用直徑3 mm 無菌鐵釘在果實赤道部位均勻刺4 個傷口（2 mm×3 mm）。自然晾干后，每個傷口接種10 μL T.roseum 孢子懸浮液（1×106個孢子/mL）。室溫下干燥4 h 后，將10 μL 不同濃度（0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL）的L.plantarum CY1-2 接種于同一傷口，自然干燥后，于（25±1）℃、相對濕度65%±5%條件下貯藏，接種培養3 d 后用十字交叉法測定病斑直徑，每2 d 測量1 次。每個濃度使用30 個果實。

綜合以上結果篩選能夠顯著抑制T.roseum 生長的最低L.plantarum CY1-2 濃度。

1.2.4 細菌液體培養

分別取2.0mLT.roseum 孢子懸浮液和L.plantarum CY1-2 懸浮液加入到MRS 液體培養基中（T. roseum培養2 瓶，L.plantarum CY1-2 培養1 瓶），置于恒溫振蕩器中（26 ℃、120 r/min）振蕩培養3 d，在其中1 瓶T.roseum 培養液中加入L.plantarum CY1-2，使終濃度為1.0×105CFU/mL。每2 h 分別取4 mL 菌液，于4 ℃下離心（12 000 r/min）10 min，收集各個時間段的上清液及沉淀進行電導率、丙二醛和胞外泄漏物含量的測定。

1.2.5 測定項目與方法

1.2.5.1 相對電導率

參考Wei 等[11]的方法并稍作修改。將“1.2.4”所述沉淀用無菌水清洗3 次，加至含有30 mL 無菌水的三角瓶中，25 ℃保溫30 min，測定電解質滲漏值（D1），隨后將三角瓶于95 ℃保溫30 min，測量菌體被殺死后電解質滲漏值（D2）。相對電導率計算公式如下：

相對電導率（%）=D1/D2×100

1.2.5.2 MDA、胞外蛋白和可溶性糖含量

參照Wei 等[11]的方法進行測定。胞外蛋白含量取“1.2.4”所述上清液0.5 mL 放入試管中，加入2.5 mL考馬斯亮藍G-250 溶液，充分混合，放置2 min 后在595 nm 波長下測定其吸光度值。可溶性糖含量取“1.2.4”所述上清液0.2 mL 于試管中，然后向試管中依次加入1.8 mL 無菌蒸餾水、0.2 mL 蒽酮-乙酸乙酯溶液和0.6 mL 濃硫酸，充分混勻，自然冷卻后在625 nm波長下測定吸光度值。胞外蛋白和可溶性糖含量參照牛血清白蛋白和蔗糖的標準曲線計算，以μg/mL 表示。

MDA 含量（μmol/L）=6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450式中：OD450、OD532、OD600分別代表450、532、600 nm 波長處的吸光度值。

1.2.5.3 細胞存活率測定

參考Li 等[30]的方法并稍作修改。向3 個錐形瓶中各加入100 mL 100 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4，含2.0 g D-葡萄糖）。向其中2 個錐形瓶中加入2.0 mL T. roseum 孢子懸浮液，最后一個錐形瓶中加入L.plantarum CY1-2，使終濃度為1.0×105CFU/mL。將L. plantarum CY1-2（1.0×105CFU/mL）加入接種T.roseum 的兩個錐形瓶中，置于恒溫振蕩器（26 ℃、120 r/min）振蕩培養0、3、6、12、24、48 h 后10 000 r/min離心5 min，用磷酸緩沖液洗滌2 次，使孢子懸浮于500 μL 磷酸緩沖液（10.0 mmol/L，pH 7.4）中。用10 μL 碘化丙啶（5.0 mg/mL）顯色，然后置于黑暗條件下（28 ℃）靜置培養30 min，以10 000 r/min 離心5 min，再用磷酸緩沖液洗滌2 次，使孢子懸浮于500 μL 磷酸緩沖液（10.0 mmol/L，pH 7.4）中。用Accuri C6 流式細胞儀檢測。每個樣本作3 個重復，每個重復選擇10 000 個孢子。

1.2.6 數據處理

全部指標進行3 次生物學重復，采用Microsoft Excel 2010 進行數據分析、作圖并計算標準誤差，采用SPSS 22.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度L.plantarum CY1-2 處理對T.roseum菌絲生長和孢子萌發的影響

由表1 可知，在對照和添加1.0×101、1.0×102、1.0×103CFU/mL L. plantarum CY1-2 的PDA 平板上T. roseum 均能生長，菌落直徑隨培養時間的延長而增大，并隨L. plantarum CY1-2 濃度的增加而減小。L. plantarum CY1-2 濃度分別為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL 時，T. roseum 的生長完全受到抑制。培養4 d 時，1.0×101、1.0×102CFU/mL L. plantarum CY1-2 處理與對照之間無顯著性差異，但1.0×103CFU/mL L.plantarum CY1-2 處理顯著抑制了T.roseum 菌落的生長。

表1 不同濃度L.plantarum CY1-2 處理對T.roseum 菌絲生長的影響Table 1 Effects of L.plantarum CY1-2 at different concentrations on mycelial growth of T.roseum 單位：mm

由表2 可知，不同濃度的L.plantarum CY1-2 均能顯著抑制T.roseum 孢子萌發，且隨著L.plantarum CY1-2 濃度的增大，其抑制效果增強。培養20 h 時，對照T.roseum 的萌發率為93.25%，添加1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL L.plantarumCY1-2 的T.roseum 萌發率分別為86.50%、64.25%、53.50%、42.50%、35.75%、30.75%、24.50%。

表2 不同濃度L.plantarum CY1-2 處理對T.roseum 孢子萌發率的影響Table 2 Effects of L.plantarum CY1-2 at different concentrations on conidia germination rate of T.roseum 單位：%

結合體內和體外試驗結果，選擇1.0×105CFU/mL的L.plantarum CY1-2 進行后續試驗。

2.2 不同濃度L.plantarum CY1-2 對損傷接種番茄果實病斑直徑的影響

由表3 可知，與對照相比，L.plantarum CY1-2 處理能抑制接種T.roseum 番茄果實的病斑直徑。不同濃度L. plantarum CY1-2 處理的番茄果實接種的T. roseum 均能生長，1.0×106、1.0×107CFU/mL 的L. plantarum CY1-2 處理則于培養3 d 后完全抑制了病斑的生長，而其他濃度處理的病斑直徑隨著培養時間的延長而增大。培養至第5 天時，1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105CFU/mL 濃度的L. plantarum CY1-2 處理均顯著抑制了T.roseum 菌絲生長。在貯藏至第7 天時，L.plantarum CY1-2 在1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105CFU/mL 濃度下對番茄果實病斑的抑制率分別為17.25%、30.46%、44.47%、46.09%、51.21%。1.0×103、1.0×104、1.0×105CFU/mL L.plantarum CY1-2 處理之間番茄果實的病斑直徑無顯著差異。

表3 不同濃度L.plantarum CY1-2 處理對損傷接種T.roseum 番茄果實病斑直徑的影響Table 3 Effects of L.plantarum CY1-2 at different concentrations on lesion diameter of tomato fruit inoculated with T.roseum單位：mm

2.3 L.plantarum CY1-2 處理后T. roseum 相對電導率和MDA 含量的變化

相對電導率與細胞膜透性的大小呈正相關關系，即細胞膜遭到破壞，細胞內部電解質會逐漸向外滲漏，從而引起溶液相對電導率的上升。由圖1A 可知，在整個培養期間，單獨接種T.roseum 培養液及同時接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養液的相對電導率隨培養時間的延長呈下降趨勢。單獨接種L. plantarum CY1-2 培養液的相對電導率變化幅度不大；接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養液的相對電導率在0 h 和6～8 h 均高于單獨接種T. roseum培養液，但在2 h 和4 h 時差異不顯著。由此說明，L. plantarum CY1-2 在培養后期破壞了T. roseum 細胞膜結構，使菌體內部的電解質外泄至溶液中，從而使電導率上升。

圖1 L.plantarum CY1-2 處理對T.roseum 相對電導率（A）和MDA 含量（B）的影響Fig.1 Effects of L.plantarum CY1-2 treatment on the relative conductivity(A)and malondialdehyde content(B)of T.roseum

MDA 是細胞膜脂過氧化作用的主要產物之一，反映生物膜危害程度。由圖1B 可知，單獨接種T. roseum 培養液、同時接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養液與單獨接種L. plantarum CY1-2 培養液中MDA 含量在0～6 h 均隨培養時間的延長而升高，在6～8 h 時隨培養時間的延長而降低。在整個培養過程中，同時接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 的培養液中MDA 含量比單獨接種T. roseum 培養液顯著提高（P＜0.05）。由此說明，L. plantarum CY1-2破壞了T.roseum 細胞膜結構。

2.4 L.plantarum CY1-2 處理對T. roseum 胞外可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

胞外可溶性蛋白含量的高低在一定程度上能夠反映細胞膜的受損程度。由圖2A 可知，單獨接種T. roseum 培養液、接種T. roseum 和L. plantarum CY1-2 培養液及單獨接種L. plantarum CY1-2 培養液中胞外可溶性蛋白質含量在0～4 h 均有所增加，在4～8 h 基本不變。在整個培養過程中（6 d 除外），同時接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養液中胞外可溶性蛋白含量均明顯高于單獨接種T. roseum 培養液和單獨接種L. plantarum CY1-2 培養液。

由圖2B 可知，單獨接種T.roseum 培養液、同時接種T.roseum 和L.plantarum CY1-2 培養液及單獨接種L. plantarum CY1-2 培養液中可溶性糖含量在培養過程中呈上升趨勢。與單獨接種T.roseum 培養液和單獨接種L.plantarum CY1-2 培養液相比，同時接種T. roseum 和L.plantarum CY1-2 培養液中胞外可溶性糖含量顯著提高（P＜0.05）。

圖2 L.plantarum CY1-2 處理對T.roseum 胞外可溶性蛋白含量（A）和可溶性糖含量（B）的影響Fig.2 Effects of L.plantarum CY1-2 treatment on the extracellular soluble protein(A)and soluble sugar(B)contents of T.roseum

2.5 L.plantarum CY1-2 處理對T. roseum 細胞存活率的影響

圖3 表明，在T. roseum 孢子懸浮液中添加L.plantarum CY1-2 后，0～24 h T.roseum 細胞存活率總體呈下降趨勢，24～48 h 呈上升趨勢，12 h 存活率顯著低于單獨接種T. roseum 培養液（P＜0.05），0～6 h和24～48 h 的細胞存活率無明顯差異。

圖3 L.plantarum CY1-2 處理對T.roseum 細胞存活率的影響Fig.3 Effects of L.plantarum CY1-2 treatment on the cell survival rate of T.roseum

3 討論

將乳酸菌添加到食品中作為生物防腐劑使用能有效地避免由化學防腐保鮮劑帶來的不利影響[31]。本研究表明，不同濃度的L.plantarum CY1-2 可以抑制體外條件下T.roseum 的菌絲生長和孢子萌發，且抑制率與濃度呈正相關。此外，L.plantarum CY1-2 對損傷接種T.roseum 番茄果實的病斑直徑有顯著的抑制作用。Li 等[32]發現植物乳桿菌XCT1-10 對灰霉病菌的菌絲生長和孢子萌發均有抑制作用，且呈劑量依賴關系。Lü 等[26]研究表明，植物乳桿菌C10 在體外條件下能顯著抑制T.roseum 菌絲生長。T.roseum 是一種堿性真菌，會在高pH 值環境下引起果蔬腐爛[33]。乳酸菌發酵會產生多種抑菌物質，主要產物乳酸可通過降低生長環境的pH 值直接抑制菌絲生長和孢子萌發，從而降低其致病性。然而，要全面了解乳酸對T. roseum 致病性的影響，還需要進一步的研究。

細胞膜在細胞生命中起著至關重要的作用，細胞膜的破壞會擾亂細胞內的動態平衡，甚至導致細胞死亡[34]。相對電導率和相對電解質滲漏通常用來表示細胞膜的通透性和細胞膜的受損傷程度。培養4 h 后，添加L. plantarum CY1-2 培養液的相對電導率高于單獨接種T.roseum 的培養液。黃玉琴等[35]研究發現，Bacillus pumilus HN-10 發酵液蛋白粗提物顯著提高了T.roseum 液體培養條件下的電導率，主要原因是細胞膜完整性被破壞，從而打破了菌體的保護屏障。Wei 等[11]發現，使用ε-聚賴氨酸處理對T. roseum 生長的抑制及相對電導率的變化與電解質滲漏有關。本研究表明，L.plantarum CY1-2 處理破壞了T. roseum孢子胞內外電解質的平衡，提高了T.roseum 細胞膜的透性。

MDA 是細胞膜中膜脂過氧化反應的主要產物之一，可引起蛋白質、多糖、核酸和其他大分子的交聯反應。本研究表明，L.plantarum CY1-2 處理僅在6 h 提高了膜脂過氧化產物MDA 的含量，其他時間沒有顯著性差異，說明L.plantarum CY1-2 處理在一定程度上促進了T.roseum 細胞膜的脂質過氧化。有研究表明，離體條件下，磷酸鈉、ε-聚賴氨酸處理與抑制T. roseum 生長、破壞其細胞膜結構、提高其胞外MDA含量密切相關[11-13]。

細胞內容物滲漏是細胞膜損傷的一個重要指標。本試驗發現，接種L.plantarum CY1-2 后，T. roseum胞外蛋白質含量均明顯高于單獨接種T. roseum 或L.plantarum CY1-2 的培養液（6 d 除外），可溶性糖含量明顯高于單獨接種T.roseum 或L.plantarum CY1-2 的培養液。由此說明，L. plantarum CY1-2 破壞了T. roseum 細胞膜的完整性，導致胞內蛋白向外滲漏增多，同時導致了T.roseum 新陳代謝水平降低甚至紊亂，致使其分泌的胞外可溶性糖含量升高，嚴重影響了其正常生長和代謝。本研究結果與植物乳桿菌XCT1-10 對灰霉病菌的抑制結果一致[32]。Niu 等[36]研究表明：經硅酸鈉處理后，T.roseum 的可溶性糖和可溶性蛋白質含量高于對照；此外，使用流式細胞儀檢測T.roseum 孢子細胞膜完整性，發現經L. plantarum CY1-2 處理12 h 時，T.roseum 的細胞存活率顯著低于對照，但除12 h 外，對照與L. plantarum CY1-2 處理的細胞存活率無顯著差異，表明L.plantarum CY1-2破壞了T. roseum 孢子的細胞膜并影響其代謝，但并沒有直接殺死T.roseum。

對微生物細胞膜進行破壞是一些化學物質作為潛在殺菌劑的作用方式。本研究表明，L. plantarum CY1-2 能夠通過破壞T. roseum 細胞膜來抑制其生長，該結論將為乳酸菌尤其是植物乳桿菌作為一種潛在的生物防腐劑提供理論依據。

4 結論

L. plantarum CY1-2 能顯著抑制T. roseum 的菌絲生長和孢子萌發，并能明顯抑制接種T.roseum 番茄果實的病斑直徑。1.0×105CFU/mL 的L.plantarum CY1-2 對T.roseum 的抑制作用與破壞其細胞膜而使其正常生理代謝受到影響有關。