母子分離對青年CD-1雄鼠認知功能及海馬BDNF介導的LTP的影響

王亞濤，張月明，韋琪瑤，吳永芳，陳貴海

生命早期的負性生活事件如母子分離(maternal separation, MS)是神經精神類疾病的高危因素，可導致機體一系列的神經心理行為的改變，嚴重者可造成持久的情緒和認知功能障礙[1-2]，但其具體機制不明。現有研究[3]表明MS會加速子代老年期的認知功能損害，其中涉及興奮性突觸傳遞的長時程增強(long-term potentiation, LTP)受損。然而由于采取的動物品系與分離程序各不相同，MS對青年期認知功能的影響結果矛盾[4-5]，且是否涉及突觸可塑性的改變尚不清楚。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)作為內源性蛋白之一，是海馬等腦區突觸可塑性的重要調節因子[6]，在腦發育及腦功能中起關鍵作用。研究表明，MS導致的認知功能改變與BDNF水平有關[7]，后者是否聯系認知損害相關的突觸可塑性有待研究。該研究旨在探討早期MS對青年期雄鼠認知功能及海馬BDNF介導的LTP的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物CD-1小鼠(SPF級，6～8周)購自于北京維通利華責任有限公司。將14只健康CD-1孕鼠照料至其自然生產。隨后將子代雄鼠隨機分配至MS組及對照(CON)組，其中MS組的新生幼鼠在出生后第4天開始，每日上午9 ∶00—12 ∶00將母鼠與子鼠分離，直至出生后第21天斷奶，CON組不進行任何干預。期間給予母鼠及子鼠充足的食物，維持室溫22～24 ℃、濕度50%～60%、明暗周期12 h/12 h。斷奶后，將兩組幼鼠分籠飼養至3月齡。最終每組各納入13只，其中8只用于行為學、Western blot及實時熒光定量PCR的檢測，另外5只用于離體海馬LTP的誘導。實驗程序均經安徽醫科大學實驗動物委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1Morris水迷宮實驗 采用Morris水迷宮實驗評估幼鼠空間學習和記憶能力。水迷宮由一圓形水池和水下平臺組成。實驗分為定位航行期(學習期)和空間探索期(記憶期)兩部分。① 定位航行期：每次測試將小鼠頭部面向池壁隨機從4個象限投入水中，小鼠在規定時間(60 s)內爬上平臺或未能找到平臺均讓其在平臺適應30 s。每天進行4次測試，間歇15 min，實驗持續7 d。② 空間探索期：在定位航行實驗的最后一天，撤去平臺，將小鼠從靶象限的相反象限放入水中，讓其自由探索60 s。使用Any-Maze分析定位航行期中受試小鼠找到平臺的潛伏期、游泳路程及速度，以及空間探索期的靶象限時間及路程百分比。

1.2.2Western blot 采用Western blot法檢測兩組子鼠大腦海馬區BDNF的相對含量。水迷宮結束后15 d將兩組小鼠頸椎脫臼后取腦，剝離海馬組織并充分研磨后，加入RIPA細胞裂解液進行裂解。12 000 r/min離心10 min。收集上清液，在收集的蛋白樣品中按照1 ∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min，以充分變性蛋白。隨后按照Western blot法的步驟操作，一抗為BDNF抗體，二抗為羊HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG。使用Image J軟件分析蛋白條帶，計算BDNF的相對表達量。

1.2.3實時熒光定量PCR 提取海馬組織，加入TRIzol裂解液進行研磨，提取總RNA，利用分光光度計檢測其純度。使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄生成cDNA，將其作為熒光定量的模板，反應體系包括：5 μl的2×SYBR Green Mixture、1 μl的上游引物、1 μl的下游引物、1 μl的cDNA、2 μl的RNase Free water。反應條件為：95 ℃預變性、單循環1 min，95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，共計40個循環。mRNA相對含量計算方法為2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4離體海馬CA1區LTP誘導 將小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉、處死，從顱腔中取出腦組織，將切除嗅球和小腦的腦組織直立粘于標本底座，固定于標本槽內。調整刀片高度，振動切片機進行連續切片，切取包含背側海馬的400 μm厚冠狀腦片。腦片在記錄之前，在持續通入95% O2和5% CO2混合氣體的人工腦脊液中孵育1 h。加入各組藥物后進行場電位記錄。將刺激電極鎢絲電極置于海馬CA3區，玻璃記錄電極置于CA1區，記錄CA1區的場興奮性突觸后電位。場電位經放大器放大后，輸出信號經數模轉換器處理，由數據采集系統進行數據采集、分析和處理。記錄時首先找到能引起可觀察場興奮性突觸后電位(filed excitatory postsynaptic potential, fEPSP)的最小刺激，再逐漸增大刺激強度，記錄每次刺激引起的突觸前動作電位和突觸后fEPSP的幅度。刺激方波的波寬為0.1 ms，刺激頻率為0.033 Hz。以能引起最大fEPSP幅度50%的刺激強度作為測試刺激強度。給予時間間隔分別為20、40、60、80、100、150、200、400、600、800 ms和1 s的雙脈沖刺激，計算第2個fEPSP與第1個fEPSP幅度的比率。以能引起最大fEPSP幅度的50%刺激強度作為測試刺激強度，穩定記錄30 min作為基線，由高頻電刺激(100 Hz、1 000 ms ×2, 30 s間隔誘導)，誘導后持續記錄90 min。

2 結果

2.1 母子分離對小鼠空間記憶的影響定位航行期，兩組尋找平臺的潛伏期[F(6，84)=109.6，P<0.01]以及游泳路程[F(6，84)=76.06，P<0.01]均隨天數的增加而逐漸減小；與CON組小鼠相比，MS組小鼠定位航行期潛伏期[F(1，14)=30.10，P<0.01](圖1A)及游泳路程[F(1，14)=64.95，P<0.01](圖1C)增加；而處理因素×天數的交互效應對潛伏期[F(6，84)=1.813，P>0.05]及游泳路程[F(6，84)=0.956 7，P>0.05]無顯著性影響。空間探索期，與CON組小鼠相比，MS組小鼠靶象限時間百分比(P<0.05，圖1B)及游泳路程百分比(P<0.05，圖1D)均下降。游泳速度[F(6，84)=0.606 3，P>0.05]不隨天數發生改變，且組間比較無統計學差異[F(1，14)=0.724 1，P>0.05](圖1E)。

圖1 兩組CD-1小鼠在Morris水迷宮中的測試情況A：定位航行期潛伏期；B：空間探索期靶象限時間百分比；C：定位航行期游泳距離；D：空間探索期靶象限路程百分比；E：游泳速度；與CON組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 母子分離對小鼠海馬區BDNF水平的影響兩獨立樣本t檢驗結果表明，與CON組相比，MS組海馬區BDNF蛋白含量降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 兩組CD-1小鼠海馬區BDNF蛋白含量的表達比較A：BDNF蛋白條帶；B：BDNF蛋白相對含量；與CON組比較：**P<0.01

2.3 母子分離對小鼠海馬區BDNF mRNA水平的影響實時熒光定量PCR結果顯示，MS組BDNF mRNA相對含量低于CON組(P<0.05)。見圖3。

圖3 兩組CD-1小鼠海馬區BDNF mRNA水平比較與CON組比較：*P<0.05

2.4 母子分離對小鼠海馬CA1區LTP的影響使用θ爆發刺激(TBS)誘導海馬CA3-CA1通路LTP，與對照組相比，MS組LTP振幅降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 離體海馬CA1區LTPA：fEPSP模式圖；B：fEPSP相對斜率統計圖；與CON組比較：**P<0.01

3 討論

生命早期是個體神經系統發育的關鍵時期，這一時期神經元的發育及功能完善極易受應激事件的影響，引起一系列神經生物學變化，從而導致成年后的認知功能損害[1]。母子分離通過母愛剝奪這一較為溫和的手段對幼鼠進行心理打擊，常被用于探討生命早期應激影響成年后學習與記憶功能的機制。本研究顯示，經歷MS的青年期CD-1子鼠在Morris水迷宮學習期的潛伏期及游泳路程顯著延長，在記憶期靶象限時間及路程百分比顯著降低，而運動能力(即游泳速度)未發生損害。這表明嬰兒期的MS經歷可損害青年期的空間學習記憶功能。

盡管MS導致學習和記憶功能受損的機制尚不明確，但海馬作為記憶形成和維持的關鍵腦區可能參與其中。BDNF在海馬區廣泛表達，并通過與酪氨酸激酶受體B(tyrosine receptor kinase B, TrkB)結合調節下游的PI3K/AKT、PLC-γ等信號通路，進而參與認知相關神經元的功能調節[8-9]。該研究使用Western blot與實時熒光定量PCR分析結果表明，3月齡MS組海馬區BDNF的表達水平(蛋白和mRNA)顯著下降。以往母子分離研究對象多為分離程序持續整個哺乳期的大鼠或哺乳前中期的近交系小鼠。由于前者品系的差異及后者分離時間的不足，使得母子分離操作對認知功能的影響具有矛盾性[10-11]。為改善這一模型，該研究選用對更能模擬人群特點的封閉群CD1小鼠進行足夠強度的母子分離操作，并通過多種技術評估其BDNF的表達水平，同時利用電生理技術填補了該品系的小鼠LTP變化這一空白，進而顯示負性生活事件如母愛剝奪易導致海馬區BDNF的表達水平下降，從而造成持久的認知功能減退。

目前研究MS對嚙齒類動物突觸可塑性的影響，其研究對象聚焦于大鼠，而鮮有研究關注小鼠的突觸可塑性是否改變。僅有的一項研究顯示，通過檢測經歷MS操作的C57BL/6J子鼠青春期第35～55天海馬不同通路的LTP，結果提示，CA3-CA1通路的LTP尚未受損，而顆粒細胞發出的軸突組成的苔蘚纖維與CA3區錐體細胞通路的LTP下調[11]。該研究電生理結果表明嬰兒期經歷MS的青年CD-1小鼠CA3-CA1通路的LTP受損。究其原因，可能是該研究采用的動物品系、分離程序以及檢測時期的差異所致。

既往研究[9]結果表明，BDNF作為突觸可塑性的重要調節因子，參與學習與記憶功能，其機制之一是通過與TrkB受體結合發揮調節作用。另有研究[12]顯示，通過選擇性的降低海馬CA1/CA3區BDNF/TrkB的表達，在突觸前膜BDNF與TrkB結合參與LTP的誘導，二者在突觸后膜結合用于維持LTP。LTP是NMDA受體突觸傳遞效能持續增強的表現，在學習記憶過程中發揮重要作用。BDNF可以通過促進NMDAR的轉錄、翻譯過程，調節NMDAR的磷酸化水平從而促進谷氨酸突觸傳遞，這一過程依賴于突觸后TrkB的活化[13]。此外，BDNF/TrkB通路通過促進Ca2+內流，活化蛋白激酶C誘導NMDAR的轉運進而調節突觸可塑性[14]。以上研究提示，BDNF可能通過介導突觸可塑性在MS導致的青年期認知功能受損中發揮重要作用。

綜上所述，一定強度的母子分離會導致青年期雄鼠的認知功能減退，后者可能與海馬區BDNF介導的LTP受損有關。該實驗的不足之處在于未采用免疫組化技術檢測海馬各亞區BDNF含量，未進一步向腦室注射外源性BDNF或轉基因技術使BDNF在青年期過表達，觀察能否逆轉MS帶來的LTP下調及學習記憶功能的損害。此外，BDNF介導的LTP的下游通路如何參與MS導致認知功能損害的過程有待于進一步研究。