棘孢木霉特性及其對兩種草坪病原菌的生防作用

董純辛，崔 藝，牛啟塵，尹淑霞，劉若萱，古麗米婭·艾尼娃，唐若怡

(北京林業大學草業與草原學院，北京100083)

草坪是城市綠地的重要組成部分，在城市生態系統中發揮著不可替代的作用。病害管理是草坪養護管理的關鍵。草坪病害種類繁多，其中褐斑病、幣斑病是冷季型草坪高發病害。草坪褐斑病是一種危害極為嚴重的世界性草坪病害，主要由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起。立枯絲核菌寄主廣泛,能侵染所有已知草坪草，傳染迅速、發病反復，嚴重時形成大面積禿斑，極大地破壞草坪景觀[1-2]。草坪幣斑病由草坪幣斑病菌(Clarireediamonteithiana)引起，分布廣泛，我國20余省區均有不同程度的幣斑病發生和流行的相關報道[3-4]。目前草坪病害防治仍以化學防治為主，殺菌劑的大量使用不僅會引起環境污染，而且容易使病原菌產生抗藥性，進而加大病害的防治難度[5]。

木霉(Trichodermaspp.)是重要的植物病害生防真菌，對土傳真菌性病害防治效果顯著[6]，可防治由多種病原微生物引起的植物病害[6-8]。木霉生防途徑可大致分為四類，即競爭作用、重寄生作用、誘抗作用和促生作用[9-10]。目前國內外研究主要集中于從農耕土壤中分離得到的木霉及其對作物病害的防治效果[11-12]，而關于木霉防治草坪病害的研究鮮有報道，包含草坪在內的草地生態系統中的木霉種質也有待開發。

為探究從草坪根際土壤中分離得到的棘孢木霉(T.asperellum)菌株152-42對草坪褐斑病、幣斑病的防治效果，分析木霉對草坪病害病原菌的拮抗特點，本研究以立枯絲核菌和草坪幣斑病菌為拮抗材料，通過平板對抗試驗和葉片侵染試驗，檢測棘孢木霉菌株152-42對草坪病害的防治效果，分析其對2種病原菌的拮抗機理。同時，為評價棘孢木霉菌株152-42應用效果的廣泛性和穩定性[13]，本研究通過平板試驗檢測棘孢木霉152-42的溫度耐受范圍和耐鹽堿能力，分析其環境適應力，為開發草坪病害木霉生防菌劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

立枯絲核菌和草坪幣斑病菌來自北京林業大學草地保護實驗室保存的病原菌樣本，其中供試立枯絲核菌分離自草地早熟禾，草坪幣斑病菌分離自匍匐翦股穎；棘孢木霉152-42分離自北京林業大學草坪試驗基地中草地早熟禾‘午夜’(PoapratensisL. var. ‘Midnight’)草坪的根際土壤；供試植物為草地早熟禾‘優美’(PoapratensisL. var. ‘Euromyth’)和匍匐翦股穎‘Penn-A4’(AgrostisstoloniferaL. var. ‘Penn-A4’)；供試培養基為PDA(Potato Dextrose Agar)培養基和PDB(Potato Dextrose Broth)培養液。

木霉孢子懸浮液制備：棘孢木霉152-42于平板上活化5 d后，用無菌水將木霉孢子沖下，制成木霉孢子懸浮液，以血細胞計數法確定其終濃度為1×108CFU·mL-1。

1.2 棘孢木霉152-42的形態特征

將棘孢木霉152-42接種到PDA平板上，25℃培養3 d后，觀察菌落形態，并取少量菌絲于光學顯微鏡下觀察其顯微結構。

1.3 棘孢木霉對兩種病原菌的拮抗作用

1.3.1棘孢木霉對病原菌的空間競爭作用 分別從培養3 d的棘孢木霉和病原菌培養基邊緣，取直徑為9 mm的菌塊，對稱接種至PDA培養基兩端，以在培養基的一端只接種木霉或只接種病原菌作為對照。每處理重復3次。觀察木霉對病原菌的拮抗效果，25℃條件下生長3 d,7 d時分別測量木霉和病原菌的菌落直徑，計算抑制率和相對抑菌率。計算公式如下：

1.3.2木霉揮發性物質(volatile substance，VS)的抑菌效果 木霉揮發性物質采用對扣培養法檢測[14]。取直徑為9 mm木霉菌塊接種于PDA培養基中央，于25℃恒溫培養3 d。而后鋪單層無菌玻璃紙，將培養好的木霉菌完全遮蓋。將病原菌菌塊接種于另一PDA培養基中央，與接種木霉菌塊的培養皿對扣，以只接種病原菌的培養皿和空白培養皿對扣為對照，每處理重復3次。25℃培養3 d后，測量病原菌菌落直徑并計算抑制率。

1.3.3木霉非揮發物質(non-volatile substance，NVS)的抑菌效果 木霉非揮發性物質采用圓盤濾膜法檢測[14]。在PDA培養基上平鋪一張圓形玻璃紙，將木霉菌塊置于玻璃紙中央，于25℃培養3 d。去除玻璃紙及木霉菌塊，在培養皿中央接入病原菌菌塊，以未進行木霉處理的普通PDA培養基為對照，每處理重復3次。25℃培養3 d，測量病原菌菌落直徑，并計算抑制率。

1.3.4木霉誘導草坪草抗病性檢測 改進自David等的實驗方法[15]。分別移栽長勢一致的草地早熟禾和匍匐翦股穎于培養箱中，培養條件為白天28℃，夜間23℃，光照強度24 000 lx。培養7 d后，用木霉孢子濃度為1×108CFU·mL-1的懸浮液進行灌根，以蒸餾水灌根為對照，每處理重復3次。木霉灌根誘導10 d后分別以立枯絲核菌侵染草地早熟禾葉片、草坪幣斑病菌侵染匍匐翦股穎葉片。具體做法是：選取葉齡一致的新鮮離體葉片10片，表面消毒后放在濾紙上。用直徑6 mm的打孔器取培養3 d的病原菌菌塊，接于葉片中央。白天30℃，夜晚25℃,侵染48 h，觀察病斑面積，計算發病面積占葉片總面積的百分比。葉部病害分級標準參考許天委等的分類方法[16]。

1.4 棘孢木霉152-42的環境適應性

參考王強強等對拮抗性木霉菌株抗逆性篩選評價的標準與方法[17]。取直徑9 mm的棘孢木霉菌塊移至PDA培養基上，設置15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃和45℃共7個溫度梯度；設5，6，7，8，9，10，11，12和13共9個pH梯度；設50 g·L-1，100 g·L-1，150 g·L-1和200 g·L-14個NaCl濃度梯度，共計20種處理，每個處理重復3次，培養3 d后測量菌落直徑。

1.5 數據分析

利用Excel 2016進行數據處理和作圖，采用SPSS 19.0 軟件中的單因素方差分析檢驗不同處理下木霉對兩種草坪病原菌的生長抑制率、病原菌侵染葉片病情指數，采用Duncan模型分析比較不同處理間差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 木霉形態特征

棘孢木霉152-42菌落呈深綠色，毛發狀(圖1A)。分生孢子梗細長彎曲，形成墊狀，分生孢子大小平均為2.50 μm×1.90 μm，淺綠色，橢圓形或倒卵形，有細微的棘狀突起(圖1B)。

圖1 棘孢木霉152-42形態Fig.1 Morphology of Trichoderma asperellum 152-42注：圖A為PDA上菌落形態；圖B為光學顯微鏡照片Note：Figure A,Colony morphology on PDA;Figure B,Morphology under light microscope

2.2 環境適應性

2.2.1高溫脅迫 如表1和圖2所示，棘孢木霉152-42在15～45℃范圍內均可生長，但最適生長溫度為25～35℃，在此范圍內木霉菌株生長速度快，3 d內可將培養基完全覆蓋。15℃時，木霉生長受到抑制，3 d內只能覆蓋培養基的一半。40℃和45℃時木霉仍能存活，但在培養基上只觀察到少量菌絲生長。

表1 木霉在不同溫度、pH、NaCl濃度下培養3 d的生長狀況Table 1 Growth of Trichoderma cultured at different temperatures，pH，NaCl concentrations for 3 days

圖2 棘孢木霉152-42在不同溫度下培養3 d的生長狀況Fig.2 Growth of Trichoderma asperellum 152-42 cultured at different temperatures for 3 days注：圖A～G分別為棘孢木霉152-42在15℃,20℃,25℃,30℃,35℃,40℃,45℃溫度下培養3 d的生長狀況Note：Figure A～G，Growth status of Trichoderma asperellum 152-42 cultured at 15℃,20℃,25℃,30℃,35℃,40℃,45℃ for 3 days

2.2.2堿脅迫 由表1和圖3可知，棘孢木霉152-42在pH為5～12條件下菌絲生長迅速，3 d內長滿培養皿。在pH為13時其菌絲生長受到明顯抑制，在pH為14的培養基上無法生長。

圖3 棘孢木霉152-42在不同pH培養基中培養3 d的生長狀況Fig.3 Growth of Trichoderma asperellum 152-42 cultured at different pH values for 3 days注：圖A～I為棘孢木霉152-42在pH分別為5,6,7,8,9,10,11,12,13時培養3 d的生長狀況Note：Figure A～I,Growth of Trichoderma asperellum 152-42 cultured for 3 days under pH=5,6,7,8,9,10,11,12,13

2.2.3鹽脅迫 由表1及圖4可以看出，棘孢木霉152-42在NaCl濃度為50 g·L-1，100 g·L-1，150 g·L-1條件下均可正常生長，在3 d內長滿培養皿，菌落顏色亦正常。在NaCl濃度為200 g·L-1時木霉不能生長。

圖4 棘孢木霉152-42在不同NaCl濃度下培養3 d的生長狀況Fig.4 Growth of Trichoderma asperellum 152-42 cultured at different NaCl concentrations for 3 days注：圖A～D分別為棘孢木霉152-42在NaCl濃度為50 g·L-1，100 g·L-1，150 g·L-1，200 g·L-1下培養3 d的生長狀況Note：A～D,Growth of Trichoderma asperellum 152-42 cultured at NaCl concentrations of 50 g·L-1,100 g·L-1，150 g·L-1 and 200 g·L-1 for 3 days

2.3 木霉對病原菌的拮抗作用分析

木霉分別與立枯絲核菌和草坪幣斑病原進行拮抗共培養3 d，木霉對病原菌的生長抑制情況如表2和圖5所示。

由圖5B和圖5C可以看出，對峙培養3 d，棘孢木霉對兩種病原菌均有明顯的抑制效果，其中立枯絲核菌菌絲發黃萎縮，抑制率達到56.67%；幣斑病菌菌落邊緣輕微發黃，但菌絲沒有大面積萎縮，抑制率為41.98%。相比較而言，對峙培養的棘孢木霉152-42對立枯絲核菌的抑制率顯著高于其對幣斑病菌的抑制率(P<0.05)。

表2 棘孢木霉對兩種草坪病原菌的生長抑制率Table 2 Growth inhibition rates of Trichoderma asperellum 152-42 to two pathogens

圖5 棘孢木霉152-42與兩種病原菌共培養3 d的拮抗作用Fig.5 Antagonism of Trichoderma asperellum 152-42 on 2 pathogens post 3 days co-culture注：A,棘孢木霉152-42對照；B-C,棘孢木霉152-42與立枯絲核菌、幣斑病菌對峙培養；D,立枯絲核菌對照；E-F,棘孢木霉152-42揮發性代謝物對立枯絲核菌、幣斑病菌的拮抗作用；G,幣斑病菌對照；H-I,棘孢木霉152-42非揮發性代謝物對立枯絲核菌、幣斑病菌的拮抗作用Note：A,Trichoderma asperellum 152-42 control;B-C,Trichoderma asperellum 152-42 was cultured in confrontation with Rhizoctonia solani and Clarireedia monteithiana;D,Rhizoctonia solani control;E-F,Antagonism of volatile substance from Trichoderma asperellum 152-42 on Rhizoctonia solani and Clarireedia monteithiana;G,Clarireedia monteithiana control;H-I,Antagonism of non-volatile substance of Trichoderma asperellum 152-42 against Rhizoctonia solani and Clarireedia monteithiana

VS培養3 d，立枯絲核菌生長正常，幾乎沒有受到棘孢木霉揮發性代謝物的影響(圖5E)；但幣斑病菌的生長受到明顯抑制，抑制率達到82.25%，幣斑病菌菌落直徑僅為1.5 mm(圖5F)。可見，棘孢木霉152-42的揮發性代謝物可有效抑制幣斑病菌的生長，但對立枯絲核菌幾乎無效。

NVS培養3 d，棘孢木霉的非揮發性代謝物對立枯絲核菌具有明顯的抑制作用(圖5H)，平板上僅有少量菌絲生長，且菌絲發黃，抑制率達到55.00%，與對峙培養的抑制率相近。同時，棘孢木霉的非揮發性代謝物對幣斑病菌亦有明顯的抑制效果(圖5I)，抑制率達到85.83%，是對峙培養時抑制率的2倍。相比較而言，NVS培養的棘孢木霉152-42對幣斑病菌的抑制率顯著高于其對立枯絲核菌的抑制率(P<0.05)。

木霉與兩種病原菌對峙培養7 d，木霉將立枯絲核菌的菌絲完全覆蓋，已無法觀察到立枯絲核菌(圖6B)；木霉也覆蓋了幣斑病菌的大部分菌絲，僅余幣斑病菌初期生長的菌絲(圖6D)。

圖6 棘孢木霉152-42與病原菌對峙共培養7 dFig.6 Trichoderma asperellum 152-42 was cultured in confrontation with the pathogen for 7 days注：A,立枯絲核菌對照；B,棘孢木霉152-42與立枯絲核菌對峙培養；C,幣斑病菌對照；D,棘孢木霉152-42與幣斑病菌對峙培養Note：A,control of Rhizoctonia solani;B,Trichoderma asperellum 152-42 was cultured in confrontation with Rhizoctonia solani;C,control of Clarireedia monteithiana;D,Trichoderma asperellum 152-42 was cultured in confrontation with Clarireedia monteithiana

2.4 木霉誘導草坪草抗病性檢測

由圖7可知，棘孢木霉152-42灌根誘導后的草地早熟禾葉片在立枯絲核菌侵染后48 h，褐斑病病情指數為51.3，顯著低于對照(P<0.05)；相應地，幣斑病菌侵染后48 h，經木霉誘導的匍匐翦股穎葉片幣斑病病情指數為54.6，亦顯著低于對照葉片(P<0.05)。

圖7 病原菌侵染48 h葉片病情指數Fig.7 Disease index of leaves post pathogens infection 48 h注:圖中*表示該處理下葉片病情指數顯著高于另一組(P<0.05)Note：* indicates significant differences between two treatments at the 0.05 level

從圖8也可以看出，病原菌侵染葉片后48 h，與對照葉片相比，經木霉誘導的葉片，其病斑面積小，發病程度輕。

圖8 病原菌侵染48 h葉片發病情況Fig.8 Leaf lesions post pathogens infection 48 h注：A,立枯絲核菌侵染草地早熟禾對照葉片，B,立枯絲核菌侵染經棘孢木霉152-42誘導的草地早熟禾葉片；C,幣斑病菌侵染匍匐翦股穎對照葉片;D，幣斑病菌侵染經棘孢木霉152-42誘導的匍匐翦股穎葉片Note：A,Control leaf of Kentucky bluegrass were infected by Rhizoctonia solani; B,Kentucky bluegrass leaf induced by T. asperellum 152-42 were infected by Rhizoctonia solani;C,Control leaf of Creeping bentgrass were infected by Clarireedia monteithiana;D,Creeping bentgrass leaf induced by T. asperellum 152-42 were infected by Clarireedia monteithiana

3 討論

3.1 棘孢木霉152-42的生防途徑

棘孢木霉152-42在與兩組病原菌和病原寄主草坪草的互作過程中，表現出對病原菌生長強烈的抑制作用，并誘導草坪草對病原菌侵染產生抗性。

分泌拮抗代謝物是棘孢木霉拮抗病原菌的重要方式。Oszako研究認為棘孢木霉能抑制櫟樹白粉病的發生，這得益于其多種拮抗代謝物的分泌[18]。陶玲蕓等認為拮抗代謝物的分泌是棘孢木霉拮抗尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的重要途徑[19]。本研究中棘孢木霉152-42代謝產生的揮發性次生代謝物和非揮發性次生代謝物均強烈抑制了草坪幣斑病菌的生長，但對立枯絲核菌的抑制作用相對較弱，特別是棘孢木霉152-42揮發性次生代謝物對立枯絲核菌幾乎沒有抑制作用，說明棘孢木霉152-42代謝物對病原菌的拮抗作用效果在不同病原菌之間存在差異。

木霉拮抗代謝物種類繁多，Stracquadanio等分析了液體發酵條件下木霉的拮抗代謝物種類，研究表明供試的棘孢木霉可產生7類揮發性有機物和12種非揮發性有機物分子，而每種代謝物的拮抗作用機理不盡相同[20]。本文中棘孢木霉152-42的拮抗代謝物種類及對不同病原菌的拮抗作用機理有待進一步分析。

木霉與病原菌對峙共培養7 d的結果表明，棘孢木霉對立枯絲核菌有強烈的拮抗作用，共培養7 d后立枯絲核菌的菌絲全部被木霉覆蓋，抑制率達到100%，但NVS培養試驗結果表明棘孢木霉152-42的代謝物對立枯絲核菌的抑制率顯著低于其對幣斑病菌的抑制率，這表明供試木霉可能通過其他拮抗途徑，如空間競爭、重寄生等在對峙培養過程中對立枯絲核菌發揮作用[21]。

木霉可增強植物的抗病性，誘導植物產生系統性抗性[22]。Meyer等研究表明，在植物的葉部接種木霉，植物不同空間位置對病原菌抗性都得到了提高，表明木霉誘導植物產生了對病原真菌的系統性抗性[23]。本試驗中，草地早熟禾和匍匐翦股穎經棘孢木霉152-42灌根誘導后，與未經木霉誘導的對照葉片相比，葉片上褐斑病和幣斑病的病情嚴重指數均明顯減輕，誘導位點在草坪草根部，但葉片表現出了病原菌抗性，說明該木霉誘導草坪草產生了系統性抗性。

3.2 棘孢木霉152-42的環境適應性

棘孢木霉152-42具有耐高溫、耐高鹽堿的特性。

夏季是冷季型草坪受病害影響最為嚴重的時期，常見如彎孢霉葉斑病(Curvularialeaf spot)、鐮刀菌枯萎病(Fusariumdisease)、褐斑病(Brown patch)、腐霉枯萎病(Pythiumdisease)、夏季斑枯病(Summer patch)[24]。棘孢木霉152-42能夠耐一定程度的高溫脅迫，在35℃下仍可以正常生長，即能在夏季草坪土壤中正常生長，因此可以認為棘孢木霉152-42具有用于草坪的夏季病害管理的潛力。

棘孢木霉152-42在pH為5～12可正常生長，參照鄭柯斌等的抗逆篩選評價標準[25]，該木霉耐高堿。尹大川等研究NaCl脅迫下哈茨木霉(Trichodermaharzianum)生長情況時發現，在NaCl濃度為50 g·L-1時其生長明顯受到抑制[26]，而本研究中的棘孢木霉152-42在NaCl濃度為150 g·L-1時仍可正常生長，與在正常鹽度下的生長速度無顯著差異，說明其具有更強的耐鹽性。棘孢木霉152-42耐高鹽堿的特性使得其可以防治鹽堿地草坪的病害。

3.3 草地生態系統中木霉種質資源的潛在價值

草地是地球表面覆蓋較廣的主要生態系統之一，蘊含的大量生態服務功能及價值有待開發和評估[27]。Dou等對中國多種生態系統中的木霉多樣性進行評估，發現在農作物土壤中的木霉豐度最高，草地生態系統中分離得到的木霉種類和數量最低，但有兩種木霉只在草地生態系統中分離得到，這表明草地生態系統具有其特殊性[28]。Ma等對新疆地區的草地和森林生態系統中的木霉分布進行了評價分析，試驗表明木霉更適宜在森林生態系統中存活，森林生態系統中木霉豐度顯著高于草地生態系統，但部分種類木霉，如鉤狀木霉、短密木霉等只能從草地生態系統中分離得到[29]。草坪屬于農業管理條件下的草地生態系統，棘孢木霉152-42表現出極強的耐鹽堿能力，這與其獨特的生境密不可分。包括草坪在內的草地生態系統中的微生物資源還有待進一步研究開發。

4 結論

來源于草坪草根際土壤的棘孢木霉152-42環境適應范圍廣，可耐35℃高溫，在NaCl濃度為150 g·L-1、pH為5～12可正常生長，可通過空間競爭、分泌拮抗代謝物等途徑顯著抑制立枯絲核菌、幣斑病菌生長。以棘孢木霉152-42灌根誘導草坪草后，可明顯降低褐斑病和幣斑病的病情嚴重程度，因此具有開發為草坪病害生防菌劑的良好潛力。以棘孢木霉152-42為代表的草地生態系統中的有益微生物亟待進一步研究、開發與應用。