干旱脅迫后復水對新疆大葉苜蓿幼苗光合和葉綠素熒光的影響

南思睿，羅永忠，于思敏，何 鈺，仝慧鑫

(甘肅農業大學林學院，甘肅 蘭州 730070)

隨著全球氣候的變暖，極端干旱天氣日益頻發[1]，導致植物干旱缺水的情況愈加嚴重。在干旱、半干旱地區，由于降雨少且分配不均，植物遭受的干旱脅迫往往存在一定的階段性。受該地區降雨格局的影響，植物生長環境經常出現干旱與降水交替的現象[2]。當植物受到干旱脅迫時，植物能否正常生長不僅取決于植物自身抗旱性的強弱，還受到干旱及復水后其恢復生長能力的影響[3]。因此，通過研究干旱脅迫及復水對植物生長的影響，對了解植物如何應對逆境脅迫環境具有重要意義。

光合作用為植物提供物質和能量，是植物最重要的生命活動之一[4]，也是植物耐旱性的評價指標之一。當土壤水分不足時，則對植物的生長發育產生抑制，顯著影響光合作用的進行[5]，同時破壞光合膜的結構，阻止各種色素的合成，導致光合作用下降[6]。研究發現，在逆境條件下，初始熒光Fo增加量越多，表明植物受損傷程度越嚴重[7]。而植物葉綠素熒光參數在受到逆境脅迫時也會發生變化，其參數變化能夠有效反映“內在性”特點[8]。干旱及復水是農業生產上常見的現象之一。當植物經過一段時間的干旱，及時的降雨能夠一定程度地修復植物的生理生化功能，補償因干旱脅迫而產生的損失[9]，不同植物或同一植物不同品種之間恢復能力的大小也不相同[10]。王磊等[11]通過對大豆(Glycinemax)干旱及復水的研究發現，在復水后，豫豆29(Glycinemaxcv. yudou29)的光合參數和熒光參數等值均能夠很快得到恢復，甚至接近對照組的水平，表明豫豆29在干旱脅迫解除后具有較強的恢復能力。因此，研究干旱及復水對植物幼苗光合和葉綠素熒光的影響，能為全面了解植物的干旱適應能力提供重要的理論依據。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是干旱、半干旱地區普遍種植且產業化發展情景良好的優良牧草[12]。因其營養價值高和產量好等優點被譽為“牧草之王”[13]。新疆大葉苜蓿(M.sativacv. xinjiangdaye)是西北地區大面積種植的紫花苜蓿品種，具有較強的抗旱性。目前，關于新疆大葉苜蓿的研究主要集中在種子萌發[14]、形態特征[15-16]、生理生化[17-21]以及品種的抗旱性鑒定[22]等方面，而對不同干旱脅迫以及復水后新疆大葉苜蓿光合生理及熒光特性影響的相關研究較少。本研究通過對1年生新疆大葉苜蓿干旱脅迫及復水的處理，探究其光合作用和葉綠素熒光的變化規律，揭示新疆大葉苜蓿對不同干旱脅迫和復水條件下的光合生理響應機制，以期為新疆大葉苜蓿的水分高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以甘肅農業大學草業學院提供的新疆大葉苜蓿種子為實驗材料。

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，在室外自然條件下進行。每個花盆(上底直徑29.5 cm，下底直徑20.0 cm、高23.0 cm)裝8.0 kg過篩(篩孔為0.5 cm)的壤土，在裝土前，每盆增施7.2 g氮肥，氮肥的比例為1∶5[1 g尿素+5 g(NH4)2HPO4]混合均勻，測得田間持水量為18.25%。2021年3月15日播種，每盆播種50粒，出苗后定苗至20株，統一防治病蟲害。

試驗共設3個不同的土壤水分梯度，即CK為對照(田間最大持水量的75%±5%)、T1為輕度脅迫(田間最大持水量的55%±5%)、T2為重度脅迫(田間最大持水量的35%±5%)，用盆栽稱重法控制土壤含水量。待紫花苜蓿長勢一致后，于2021年6月25日分別進行干旱處理，當處理組的土壤含水量下降至試驗設計要求時，進行干旱處理，7 d后進行復水至對照水平。分別測定在干旱第7 d、復水后第3 d、第5 d和第7 d時新疆大葉苜蓿的葉綠素含量、光合參數和葉綠素熒光參數。試驗期間每隔1 d用電子秤在18:00時稱重補水，降雨天用塑料棚遮蓋防雨。

1.3 試驗方法

1.3.1葉綠素含量的測定 采用研磨提取法[23]測定新疆大葉苜蓿葉綠素含量，在早上7:00采取枝條中間新鮮葉片，裝入自封袋后放入冰盒內帶回實驗室，用分光光度計在663 nm和645 nm波長下測定吸光度(A)，測定的指標包括：葉綠素a(Chlorophyll a，Chla)、葉綠素b(Chlorophyll b，Chlb)、葉綠素(a+b) [Chlorophyll (a+b),(Chl(a+b)]。公式如下：

chla=12.72×A663-2.59×A645

(1)

chlb=22.88×A645-5.03×A663

(2)

chl(a+b)=20.29×A645+8.05×A663

(3)

1.3.2光合參數的測定 在上午9∶00-11∶00，選取葉片方向、大小及長勢均一致且無病蟲害的新疆大葉苜蓿葉片用Li-6400光合儀測定，重復3次。試驗期間設定PAR為1 400 μmol·(m2·s)-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1，空氣流速500 μmol·mol-1。測定指標包括：凈光合速率(Net photosynthetic rate，Pn)、胞間二氧化碳濃度(Intercellular CO2concentration，Ci)、氣孔導度(Stomatal conductance，Gs)和蒸騰速率(Transpiration rate，Tr)等氣體交換參數，并以Pn/Tr計算瞬時水分利用效率(Water use efficiency，WUE)。

1.3.3葉綠素熒光參數的測定 在早上8∶00選取健康、長勢一致的葉片進行暗適應30 min，分別采用調制葉綠素熒光儀(PAM-2500)，測定新疆大葉苜蓿的葉綠素熒光參數，每次選取葉片重復3次。測定參數包括：初始熒光(Minimal fluorescence，Fo)、最大光化學效率(Maximal PSⅡphotochemical efficiency in the dark，Fv/Fm)、電子傳遞速率(Apparent electron transfer rate，ETR)、光化學淬滅系數(Photochemical quenching coefficient，Qp)、非光化學淬滅系數(Non-photochemical quenching，NPQ)和實際光化學量子產量(Actusal photochemical efficiency，Yield)。

1.4 數據處理

采用Excel 2010進行數據計算和圖表繪制，采用IBM SPSS Statistics 20進行方差分析(Duncan)。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫及復水對新疆大葉苜蓿葉綠素含量的影響

干旱脅迫及復水使新疆大葉苜蓿葉綠素a的含量呈現先下降后升高的趨勢(圖1A)。在干旱脅迫7 d時，與CK相比，T2處理與CK相比有顯著性差異(P<0.05)，且T1和T2處理下葉綠素a的含量降幅分別為12.0%和35.3%，復水第3 d時，新疆大葉苜蓿各處理之間差異不顯著，且呈現T1>CK>T2的趨勢。到復水第5 d和第7 d時，T1和T2處理下其葉綠素a的含量都高于CK，均出現超補償效應。

新疆大葉苜蓿葉綠素b的含量隨著干旱脅迫及復水時間的變化總體呈現先下降后增加的趨勢(圖1B)。干旱脅迫7 d時，隨著脅迫不斷加劇，其葉綠素b的含量逐漸降低，與CK相比，T1和T2處理下葉綠素b的含量降幅分別為42.3%和59.0%，且各處理之間相比均有顯著差異(P<0.05)；在復水第3 d時，與CK相比，T1處理下葉綠素b的含量增幅為16.7%，且各處理之間無顯著性差異；在復水第7 d，T1和T2處理均出現超補償效應，變化趨勢為T2>T1>CK，且T2處理與CK相比有顯著差異(P<0.05)。

如圖1C所示，隨著干旱脅迫加劇，與CK相比，新疆大葉苜蓿的葉綠素總量在T1、T2處理下呈現下降的趨勢，降幅度分別為23.7%和44.4%，且各處理與CK相比差異顯著(P<0.05)。復水3 d時，各處理間葉綠素總量值均增加，且呈現出T1>CK>T2的趨勢，與CK相比，其葉綠素總量在T1處理時明顯增加，且高于對照水平。隨著復水到第5 d和第7 d時，新疆大葉苜蓿各個處理的葉綠素總量均高于對照，均出現了超補償效應。

2.2 干旱脅迫及復水對新疆大葉苜蓿光合參數的影響

由圖2A可知，干旱脅迫及復水對新疆大葉苜蓿Pn產生了顯著的影響。在干旱脅迫7 d時，與CK相比，各個脅迫處理的Pn整體變化狀態都呈現下降趨勢，其中T1和T2處理下降幅度分別為33.3%和62.2%，且各處理之間差異顯著(P<0.05)。在復水3 d后，各個脅迫處理的Pn都有所回升，但仍顯著低于對照。而復水第5 d和第7 d時，新疆大葉苜蓿的Pn得到了一定的恢復，其Pn在各處理間均表現為T1>CK>T2，且在第7 d時各處理之間差異顯著(P<0.05)。

由圖2B可知，新疆大葉苜蓿的Ci值隨著干旱脅迫及復水時間的變化波動較大。在干旱7 d時，且各處理間差異顯著(P<0.05)，與CK相比，T1和T2處理的下降幅度為26.1%和39.7%。在復水第3 d和第5 d時，與CK相比，新疆大葉苜蓿的Ci值在T1處理時顯著增加，分別為CK的15.5%和9.8%，且T1與各處理之間差異顯著(P<0.05)，出現了一定程度的恢復。復水第7 d時各個處理均高于CK，且新疆大葉苜蓿各處理間與CK相比分別增加了12.2%和15.2%，表現出超補償效應。

由圖2C可知，隨著干旱脅迫及復水時間的變化，其Tr總體呈現先減小后增加的趨勢。在干旱脅迫7 d時，各處理之間具有顯著差異(P<0.05)；復水3 d后，其Tr有所增加，且與干旱脅迫第7 d時相比，T1和T2各處理分別增加了31.6%和60.7%，且表現為CK>T1>T2,且各處理之間差異不明顯。到了復水第5 d后，新疆大葉苜蓿的Tr出現了補償效應，表現為T1>CK>T2，且各處理間差異不明顯；復水7 d后，各個處理的Tr均有所上升，表現為T1>T2>CK，各處理之間無差異顯著。

圖1 干旱脅迫及復水對新疆大葉苜蓿葉綠素含量的影響Fig.1 The effects of drought stress and rewatering on chlorophyll content of Medicago sativa cv. xingjiangdaye注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate a significant difference among different treatments at the 0.05 level. The same as below

圖2D表明，隨著干旱脅迫及復水時間的變化，新疆大葉苜蓿的WUE總體呈現先增加后減小的趨勢。在干旱脅迫7 d時，CK與T1、T2處理之間差異顯著(P<0.05)，且表現為CKCK>T1的規律。到復水第7 d時，其水分利用效率表現為T1>CK>T2，且T2與CK和T1之間有顯著差異(P<0.05)。

由圖2E可知，干旱脅迫及復水對新疆大葉苜蓿的Gs都產生了顯著影響。干旱脅迫條件下，各個脅迫處理的Gs呈下降趨勢，表現為CKT2>T3。

圖2 干旱脅迫及復水對新疆大葉苜蓿光合參數的影響Fig.2 The effects of drought stress and rewatering on photosynthetic parameters of Medicago sativa cv. xingjiangdaye

2.3 干旱脅迫及復水對新疆大葉苜蓿葉綠素熒光參數的影響

由圖3A可知，新疆大葉苜蓿在干旱脅迫7 d時，隨著脅迫程度的加劇，Fv/Fm呈現緩慢下降趨勢，且各處理之間差異顯著(P<0.05)，與CK相比，下降幅度分別為5.4%和10.0%；在復水第3 d和第5 d時，呈現出CK>T2>T1的規律，與CK相比，新疆大葉苜蓿在T1處理出現下降的趨勢，且下降幅度分別為2.8%和7.6%。到復水第7 d時，表現為T1>CK>T2的規律，且T1處理的Fv/Fm高于CK，并出現超補償效應。

由圖3B可知，隨著干旱脅迫及復水時間的變化，新疆大葉苜蓿ETR總體變化趨勢呈現先減小后增加的趨勢。脅迫7 d時，與CK相比，新疆大葉苜蓿在各處理間差異顯著；到了復水3 d時，且呈現T1T2>CK的規律，T1和T2均出現超補償效應，且T1與CK之間相比差異顯著。

由圖3C可知，干旱脅迫及復水條件對Fo的影響總體表現為先上升后下降的趨勢。干旱脅迫7 d時，隨著脅迫程度的加深，新疆大葉苜蓿的Fo逐漸升高，其在T2水平下與CK相比差異顯著(P<0.05)。隨著復水時間的延長，復水第5 d時，新疆大葉苜蓿的Fo逐漸降低，且各處理之間無顯著性差異。在復水第7 d時，Fo表現為CK>T2>T1的規律，說明新疆大葉苜蓿的Fo已完全恢復。

如圖3D所示，新疆大葉苜蓿的NPQ隨著干旱脅迫的加劇，總體變化趨勢為逐漸減小。在干旱脅迫7 d時，隨著干旱脅迫的增加，NPQ持續上升，各處理與CK之間形成顯著性差異(P<0.05)。在復水第3 d時，NPQ在T1處理下出現明顯降低，呈現T2>CK>T1的趨勢。復水7 d后，各個脅迫處理的NPQ都低于CK，單因素方差分析表明，各處理組間均無顯著差異。

由圖3E可知，隨著干旱脅迫的加劇及復水時間的延長，新疆大葉苜蓿的Qp總體呈現上升的趨勢。在脅迫7 d時，T2處理與CK相比差異顯著，且下降幅度為22.6%。在復水3 d時，與CK相比，新疆大葉苜蓿各處理水平差異顯著，且呈現CK>T1>T2的趨勢。復水第5 d和第7 d時，新疆大葉苜蓿各處理間差異不顯著，呈現出T1>T2>CK的規律，并達到了恢復和補償效應。

如圖3F所示，干旱脅迫及復水對Yield的影響總體表現為先下降后上升的趨勢。干旱脅迫7 d時，新疆大葉苜蓿的Yield隨著土壤干旱脅迫程度的加劇而逐漸降低，CK與T1、T2處理之間差異顯著(P<0.05)，而復水第3 d時，CK與各處理之間均有顯著性差異(P<0.05)，在復水第5 d時各處理之間無顯著性差異。在復水第7 d時，新疆大葉苜蓿的Yield呈現T1>CK>T2的規律，與干旱第7 d時相比，T1和T2各處理分別增加了43.4%和59.8%。

圖3 干旱脅迫及復水對新疆大葉苜蓿熒光參數的影響Fig.3 The effects of drought stress and rewatering on fluorescence parameters of Medicago sativa cv. xingjiangdaye

3 討論

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，植物葉片內葉綠素含量的高低在一定程度上可以衡量植物抗逆性強弱[24]。有研究表明，干旱脅迫通過影響葉綠素的合成導致葉綠體超微結構損傷，使葉綠素含量降低[25]。本研究發現，新疆大葉苜蓿Chla,Chlb和Chl(a+b)隨著干旱脅迫的加劇呈逐漸降低的趨勢，復水后T1和T2處理均有所恢復，并存在顯著的補償效應，表明新疆大葉苜蓿在經過干旱脅迫后復水可以通過自身調節機制促進其葉綠素的生物合成，使葉綠素含量增加。該結論與林偉通[26]、李潔[27]的研究結果相似。但也有研究者在小麥(Triticumaestivum)[28]、大花紫薇(Lagerstroemiaspeciosa)與毛萼紫薇(Lagerstroemiabalansae)[29]上得出相反的結論，在輕中度干旱脅迫下，其葉綠素含量升高或不變，說明有些植物在生長發育過程中，其水分含量保持在一定的閾值范圍內，干旱脅迫不但對葉綠素含量不造成影響，還能促進葉綠素含量的提高，其可能原因是受干旱脅迫時間長短的影響，長時干旱脅迫下葉片擴展生長受阻，產生濃縮效應導致[28]。

植物的光合性能在受到干旱脅迫后明顯下降，且隨著脅迫的不斷加重，光合性能下降愈快，但復水后能夠產生一定的補償效應[30]。研究發現，在輕度干旱脅迫下，引起植物光合作用降低的原因主要是受氣孔限制，在重度干旱脅迫下，非氣孔因素起主要作用[31]。植物在受到干旱脅迫時，通過降低蒸騰作用、關閉氣孔，從而使光合速率降低。本研究發現,在T1和T2處理水平下，隨著Pn下降，Ci也隨之降低，因此認為在T1和T2處理下，氣孔因素是光合作用降低的主要原因。新疆大葉苜蓿在復水之后，在T1處理水平下Pn和Ci值均恢復至對照水平，甚至出現了等量補償和超補償效應，這與楊文權等[2]對小冠花的研究結果相似，說明新疆大葉苜蓿對水分條件的變化適應性較強。在T2處理下，新疆大葉苜蓿葉片的Pn恢復不明顯，說明重度干旱脅迫對新疆大葉苜蓿葉片的細胞膜結構造成了損傷，導致復水后葉片恢復能力減弱。隨著干旱脅迫的加劇，新疆大葉苜蓿的Tr和Gs逐漸降低，說明新疆大葉苜蓿受到干旱脅迫后，可以通過降低Tr和Gs來減少體內水分的散失，從而維持較高的光合強度，這與前人對鼓竹節(Bambusatuldoides‘Swolleninternode’)[32]、野生酸棗(Ziziphusjujubavar.spinosa)[33]和沙地云杉(Piceamongolica)[34]的研究相似。隨著復水時間的延長，新疆大葉苜蓿Tr和Gs均逐漸恢復至對照，主要是由于輕度脅迫對新疆大葉苜蓿的葉片造成的損傷是可逆的，在脅迫解除后Tr和Gs均能迅速恢復。對于WUE的研究結果表明：隨著土壤水分脅迫的加劇，新疆大葉苜蓿WUE逐漸升高，主要是由于氣孔開度減小，蒸騰速率降低速率大于凈光合速率升高的速率，導致WUE升高，在復水之后，WUE能夠逐漸恢復，說明新疆大葉苜蓿有極強的抗旱性。

葉綠素熒光是研究植物光合作用的有效探針，可以有效地監測植物對逆境的光化學反應機理，從而可以更全面地分析植物的光合作用過程[35]。葉綠素熒光參數對逆境脅迫非常敏感，可以反映葉片對光能的吸收、傳遞和轉換等情況[36]。Fv/Fm表示PSⅡ最大光合量子產量，反映植物的光合潛能。逆境脅迫會使Fv/Fm值降低。ETR可作為植物光合電子傳遞速率快慢的相對指標，Qp在一定程度上反映了PSⅡ反應中心的開放程度[37]，本研究發現，隨著干旱脅迫程度的加劇，新疆大葉苜蓿的Fv/Fm,ETR和Qp均降低，表明干旱脅迫會使新疆大葉苜蓿的PSⅡ反應中心受損，從而抑制光合電子的傳遞過程，影響光合電子的傳遞效率。隨著復水時間的延長，Fv/Fm、ETR和Qp仍能有效恢復，說明新疆大葉苜蓿的葉片在干旱脅迫解除后，受損的PSⅡ反應中心得到了修復，表明幼苗并未受到不可逆的損傷。Fo是PSⅡ反應中心處于完全開放時的熒光產量。Fo升高表示光合中心遭到了傷害，進而產生光抑制現象[38]。NPQ是PSⅡ處調節性能量耗散的量子產量，通過熱耗散消吸收過剩的光能，對植物光合機構免受破壞起到積極的作用[39]，是光保護的重要指標。本研究發現，新疆大葉苜蓿的Fo和NPQ隨著干旱脅迫的加劇均逐漸上升，說明新疆大葉苜蓿在受到干旱脅迫時PSⅡ反應中心活性降低，這是植物的一種保護機制。復水后新疆大葉苜蓿的Fo和NPQ均恢復至對照水平，說明新疆大葉苜蓿的葉片PSⅡ天線色素吸收的能量流向光化學的部分減少，以熱耗散和熒光形式散失的能量增加，通過提高NPQ及時耗散了過剩的光能，起到保護光合機構的作用。

Yield反映的是光下葉片的實際光能轉換效率，即用于光化學反應所占PSⅡ吸收光能的比例[40]。本研究發現新疆大葉苜蓿的Yield隨著土壤干旱脅迫程度的加劇而逐漸降低，表明不同土壤干旱脅迫使得其PSⅡ反應中心損,抑制了光合作用的原初反應,這與湯飛洋[41]對4個杜鵑品種葉綠素熒光參數的研究結果相似。復水后不同土壤干旱脅迫處理下的新疆大葉苜蓿Yield值不斷升高，在復水第7 d時T2出現了補償現象，這可能是土壤干旱脅迫對新疆大葉苜蓿造成的損傷是可逆的，其PSⅡ反應中心損及時調整自身光保護機制，使得其Yield逐漸恢復。

4 結論

隨著土壤水分脅迫的加劇，新疆大葉苜蓿的Chla,Chlb和Chl(a+b)含量均逐漸下降，復水后，新疆大葉苜蓿的葉綠素各指標均恢復至對照水平，說明干旱脅迫后復水可以促進新疆大葉苜蓿葉綠素的合成。干旱脅迫降低了Pn,Ci,Tr,Gs,Fv/Fm,ETR,Qp和Yield，同時提高了WUE,Fo和NPQ，復水后出現等量補償和超補償效應，反映出新疆大葉苜蓿幼苗具有較強的適應性和自我調節能力。