外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇種子萌發和幼苗生長的影響

閆 振，李 進，阿麗努爾·阿卜來提，謝姆斯耶·肖開提

(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，干旱區植物逆境生物學實驗室，新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊830054)

許多植物在整個生長發育過程都會受到鹽脅迫的影響，鹽脅迫是抑制種子萌發和幼苗生長的重要因素，過量的鹽會引起植物產量、生理生化、信號轉導、基因調控以及新陳代謝等一系列復雜的變化，關于鹽對植物生理生化的影響以及植物耐鹽適應機制的研究至關重要[1]。鈣是植物生長和代謝的重要調節物質之一，同時也是生理和生化反應的第二信使。前人對外源鈣的研究表明，鹽脅迫下大量Na+會與質膜結合，Ca2+內流功能受到抑制，外排能力增強，細胞內的鈣穩態被打破。施加外源鈣能夠降低Na+與質膜的結合能力，減少Ca2+的外泄，重建細胞內的鈣穩態并恢復質膜的完整性，從而緩解鹽脅迫對植物的損害[2]。李廣魯、麻瑩等人的研究顯示通過施加不同濃度的外源鈣可以緩解鹽脅迫對植物體內離子代謝、滲透調節與光合作用等方面的傷害[3-6]，植物借助鈣能夠減少根系對鈉離子的吸收、維持鉀離子的濃度以及提升抗氧化酶的保護能力進而起到對鹽脅迫的緩解效應[7]。

世界上存在極其豐富的薔薇科(Rosaceae)植物資源，目前已發現的薔薇科植物有1 000余種，主要分布在在歐亞森林、歐亞草原亞區、亞洲中部荒漠亞區[8]。薔薇科植物中包括一些獨特的物種，如單葉薔薇[Hulthemiaberberifolia(Pall.) Dumort.]。單葉薔薇隸屬于薔薇科(Rosaceae)單葉薔薇屬(HulthemiaDumort)，在亞洲中部以及西伯利亞等地均有分布，在中國只分布于新疆，且在新疆僅見于昌吉、伊犁、沙灣、塔城、瑪納斯等地，分布范圍有限[9]。單葉薔薇屬于早春植物，生長在在草場內，果肉致密飽滿，富含豐富的氨基酸和維生素，嫩葉可作為飼料供動物食用[10]。

新疆屬于鹽旱地區，生長于此種環境中的植物體極易喪失水分和養分。為了適應土壤鹽漬化的環境，單葉薔薇的葉片收縮，呈卷曲化，同時在每年的7月其進入半休眠期，很好地規避了土地水分喪失而導致的高鹽環境的影響。單葉薔薇在長期的進化發展過程中逐漸形成了自己獨特的耐鹽特性。目前，對單葉薔薇的研究主要集中在形態學、生境研究及繁殖方法等方面，而關于外源鈣對單葉薔薇抗鹽性的研究卻鮮見報道[11-14]。本研究擬在模擬鹽脅迫條件下施加不同濃度的氯化鈣(CaCl2)，通過測定種子萌發率及其幼苗的生理生化指標的變化以及分析單葉薔薇種子萌發和幼苗生長對鹽脅迫的響應特點，探究單葉薔薇對鹽脅迫的耐受性及外源鈣對鹽脅迫的緩解作用，為單葉薔薇資源保護提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究材料

于2020年7月中旬，在新疆烏魯木齊市五一農場的單葉薔薇自然分布區進行材料的采摘，選取生長相對較好的單葉薔薇植株，收集成熟的果實，貼上標簽并標記分類，帶回實驗室清洗同時剝取種皮，取出種子，篩選出完整飽滿的種粒，晾干后4℃低溫保存備用。本實驗在新疆師范大學干旱區植物逆境生物學實驗室完成。

1.2 研究方法

本實驗于2020年8月18日開始，將單葉薔薇種子浸泡在無菌水中，通過漂洗的方法除去沒有活性的、干癟的種子，最終選取相同粒厚的單葉薔薇種子進行實驗。單葉薔薇種子休眠時間長，種皮較厚，實驗前需對種子進行酸蝕處理。我們分別設置浸種時間為30 min，1 h，2 h，最終確定處理時間1 h效果明顯且對種子傷害較小。向盛有種子的燒杯注入濃硫酸，酸量以淹沒種子為度，在浸泡過程中用玻璃棒不斷攪動。處理廢棄酸液，將種子在流動水中沖洗1 h以將種皮表面殘留的酸除盡。

試驗采用雙因素設計，共設3個鹽度脅迫條件處理，用分析純試劑配置處理液，氯化鈉(NaCl)的濃度設3個水平，分別為50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，150 mmol·L-1；CaCl2的濃度設2個水平，分別為10 mmol·L-1，20 mmol·L-1，以無菌水為對照，共計10個處理，每個處理重復3次。

1.3 研究指標測定

1.3.1單葉薔薇種子萌發率的測定 按照國際種子檢驗規則，用無菌濾紙進行種子萌發實驗。供試單葉薔薇種子平均橫徑為0.21±0.04 cm，縱徑為0.35±0.06 cm。將酸蝕后的種子浸泡于75%的乙醇中消毒30 s，用蒸餾水將種皮表面的乙醇沖洗干凈，無菌濾紙吸干多余的水。在直徑為9 cm培養皿中平鋪兩層濾紙，將30粒種子均勻放置，每個處理3皿，共計90粒種子，將處理液加入至培養皿中至濾紙濕潤飽和每個培養皿中加入10 mL處理液。本項實驗在恒溫25℃智能人工氣候箱內進行，采取白天12 h，夜晚12 h的條件，周期性光照。實驗過程中輔以稱重補水法補充培養皿中蒸發的溶液，每24 h定期來補充水分[15]。種子的萌發以單葉薔薇種子露白作為標準，觀察并記錄種子的相對發芽率，當連續3天種子的數量沒有變化時視作萌發實驗結束。

種子的相對發芽率按照以下公式計算：

1.3.2單葉薔薇幼苗生長指標及其生理指標測定 萌發實驗結束后，每個處理中隨機選取15株幼苗，進行根和莖長度的測量。用游標卡尺分別測定根和芽長度，計算平均值，以mm表示。種子萌發狀況完全穩定后，即選取每個處理下生長狀態較為一致的幼苗10株進行生理生化指標的檢測[16]。超氧化物歧化酶(SOD)的活性采用羥胺法測定[17]；過氧化氫酶(CAT)的活性采用鉬酸銨法測定[18]；過氧化物酶(POD)活性采用比色法測定，利用過氧化物酶催化過氧化氫反應的原理，通過測定420 nm處吸光度的變化得出其酶活性[19]；過氧化氫(H2O2)含量的測定采用比色法，利用H2O2可以與鉬酸相互作用生成一種絡合物的特性，在405 mm處測定其生成量可計算出H2O2的含量[20]。

1.3.3單葉薔薇幼苗葉綠素含量測定 選取新鮮的單葉薔薇幼苗葉片，清潔葉片表面，切割掉葉脈，并攪拌均勻。稱取一份切好的樣品40 mg，置于5 mL EP管中，用液氮速凍，研磨兩次每次30 s，研磨完立即加入96%乙醇4 mL，搖勻后靜置5 min以備后續的測量。取上清液，在波長665 nm，649 nm和470 nm下用分光光度計測定OD值，以96%乙醇作為空白對照，記錄測量值并計算葉綠素的含量[21]。

葉綠素的含量按以下公式計算，單位為mg·L-1。

Ca=13.95D665-6.88D649

Cb=24.96D649-7.32D665

式中：Ca為葉綠素a的濃度，Cb為葉綠素b的濃度，Car為類胡蘿卜素的濃度，C為葉綠素a與葉綠素b的總和。

1.3.4單葉薔薇幼苗葉綠素熒光動力學參數測定 利用便攜式調制葉綠素熒光儀PAM-2500測定單葉薔薇幼苗的最大光化學效率(Fv/Fm)和實際光量子(YⅡ)。葉綠素熒光的測量是在完全成熟的葉片的中部原位記錄，取6株幼苗分別測量參數，并計算平均值[22]。

1.4 數據處理

實驗數據統計分析采用Microsoft Excel 2013進行原始數據處理，用SPSS 16.0分析軟件進行方差分析，采用Duncan法進行多重比較及差異顯著性檢驗(α=0.05)，圖表中數據為平均值±標準誤，采用Origin 8.0進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇種子萌發的影響

單葉薔薇種子經過酸蝕處理后種皮厚度降低，其形態如圖1所示。在不同濃度的NaCl脅迫下，其萌發率差異顯著(表1)。隨著NaCl濃度的上升，單葉薔薇的萌發率顯著降低。處理5所示當NaCl濃度為100 mmol·L-1時，單葉薔薇種子萌發受到明顯的抑制，與處理1比下降了42%。處理8所示NaCl濃度為150 mmol·L-1時單葉薔薇種子的萌發率與處理1相比下降了53%。在100 mmol·L-1濃度的NaCl下，施加濃度為10 mmol·L-1及20 mmol·L-1的CaCl2后，單葉薔薇種子的萌發率顯著提升(P<0.05)，與處理5相比分別上升了17.2%，9.8%；當NaCl的濃度為150 mmol·L-1時，施加10 mmol·L-1以及20 mmol·L-1的CaCl2單葉薔薇種子的萌發率較處理8分別提升了17.8%，8.9%，但二者無顯著性差異。

圖1 酸蝕處理后單葉薔薇種子的形態Fig.1 Seed morphology of Hulthemia Berberifolia after acid etching注：圖a、b為自然生境下單葉薔薇種子；c、d為濃硫酸處理1 h后單葉薔薇種子Note:figure a and b show the seeds of Hulthemia Berberifolia in natural habitat;figure c and d are Hulthemia Berberifolia seeds treated with concentrated sulfuric acid for 1 h

表1 外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇萌發率的影響Table 1 Effects of exogenous calcium on germination rate of Hulthemia berberifolia under NaCl stress

2.2 外源鈣對鹽脅迫環境下單葉薔薇幼苗根莖生長的影響

由圖2可知，在無外源鈣施加的情況下，隨著NaCl鹽脅迫強度的增加，單葉薔薇幼苗的根莖長度受到較為明顯的抑制作用，表現為幼苗的根莖長度顯著低于對照(P<0.05)。通過對不同濃度NaCl脅迫下的觀察可知，當NaCl的濃度為100 mmol·L-1和150 mmol·L-1時，施加濃度為10 mmol·L-1以及20 mmol·L-1的CaCl2對薔薇幼苗根莖的生長所受到的抑制有明顯的緩解作用(P<0.05)，且10 mmol·L-1CaCl2的效果更好，表現為在NaCl的濃度為100 mmol·L-1時，根莖長度較脅迫下幼苗的根莖長度分別增加了27.7%，33.4%，NaCl的濃度為150 mmol·L-1時，根莖長度分別增加了41.7%，25.4%(P<0.05)。

2.3 施加外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇幼苗葉綠素熒光參數的影響

由圖3可知，隨著NaCl濃度增高，Fv/Fm呈現出顯著降低的趨勢(P<0.05)。當NaCl的濃度為150 mmol·L-1時，施加CaCl2后Fv/Fm顯著上升，且施加濃度為10 mmol·L-1的CaCl2的效果顯著高于施加濃度為20 mmol·L-1的CaCl2(P<0.05)；由圖3可知，YⅡ對鹽脅迫的響應明顯，隨著NaCl的濃度的增加呈顯著降低的趨勢(P<0.05)，當NaCl的濃度為150 mmol·L-1時，施加濃度為10 mmol·L-1的CaCl2的效果顯著高于施加濃度為20 mmol·L-1的CaCl2(P<0.05)。

圖2 外源鈣對NaCl脅迫下單葉薔薇幼苗根長、莖長的影響Fig.2 Effects of exogenous calcium on root length and stems length of Hulthemia berberifolia seedlings under NaCl Stress注：圖中數值為平均值±標準差，圖中不同小寫字母表示不同NaCl與CaCl2濃度處理間顯著差異(P<0.05)，下同Note:The values in the table are mean±standard deviation,Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different concentrations of NaCl and CaCl2treatment at the 0.05 level,the same as below

圖3 外源鈣處理對鹽脅迫下單葉薔薇幼苗葉綠素熒光的影響Fig.3 Effects of exogenous calcium on Chlorophyll Fluorescence of Hulthemia berberifolia Seedlings under Salt Stress

2.4 外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇幼苗葉片中的光合色素含量

由表2可知，隨著鹽脅迫強度的增加，單葉薔薇幼苗中的光合色素的含量呈下降趨勢，當NaCl的濃度為150 mmol·L-1時效果最為顯著(P<0.05)；當NaCl的濃度為50 mmol·L-1時，葉綠素總含量較對照相比下降了18.1%；當NaCl的濃度為100 mmol·L-1時，葉綠素總含量較對照相比下降了28.9%。外源鈣的施加緩解了鹽脅迫對光合作用的抑制，10 mmol·L-1的CaCl2效果優于20 mmol·L-1的CaCl2，具體表現為較同等脅迫下葉綠素及類胡蘿卜素分別上升了20.9%，17.1%。當NaCl的濃度為150 mmol·L-1時，葉綠素總含量較對照相比下降了50.2%，施加10 mmol·L-1的CaCl2后較同等脅迫下葉綠素及類胡蘿卜素分別上升了33.7%，16.7%(P<0.05)。

表2 外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇幼苗的光合色素含量的影響Table 2 Effects of CaCl2 on the photosynthetic pigment content in the Hulthemia berberifolia seedlings under salt stress

2.5 外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇幼苗抗氧化酶活性和H2O2含量的影響

由圖4可知，在受到鹽脅迫后，單葉薔薇幼苗中POD、SOD和CAT的活性顯著升高，但隨著脅迫強度的增加，POD、SOD和CAT活性呈先增后降的趨勢，且在NaCl濃度為100 mmol·L-1時三種酶的活性最高(P<0.05)；在該濃度下，施加濃度為10 mmol·L-1的CaCl2后單葉薔薇幼苗POD、SOD和CAT活性與未施加相比分別提升22.3%，9.9%，17.3%。NaCl濃度為100 mmol·L-1時，施加濃度為10 mmol·L-1的CaCl2后單葉薔薇幼苗中三種酶的活性顯著高于施加20 mmol·L-1的CaCl2時的酶活性(P<0.05)。此外，過氧化氫的含量隨著NaCl濃度的增加而呈現顯著上升趨勢(P<0.05)。

圖4 外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇幼苗氧化酶活性和H2O2含量的影響Fig.4 Effects of exogenous calcium on oxidase activity and H2O2 Content of Hulthemia berberifolia seedlings under salt stress

2.6 主成分分析

采用主成分分析法(PCA)研究了外源鈣對鹽脅迫下單葉薔薇種子萌發、生長及幼苗生化指標的影響，結果如圖5所示。主成分別為主成分1(PC1)解釋了總變異性的58.4%和主成分2(PC2)解釋了總變異性的27.3%。從各組樣本之間的總體分布結果可以得到，在PC1的方向上，無CaCl2添加的情況下，鹽脅迫被很好的分離開，NaCl濃度越高對單葉薔薇種子及幼苗的作用越明顯：在PC2的方向上可得，當NaCl濃度確定時，施加濃度為10 mmol·L-1的CaCl2的效果優于施加20 mmol·L-1的CaCl2，且根據二者在PC2的方向上的分布情況進行比對，確定CaCl2的濃度為10 mmol·L-1效果最好。

圖5 主成分分析法(PCA)對不同處理下單葉薔薇種子萌發、生長及生化指標進行分析Fig.5 The main analysis of Components (PCA) was used to analyze the germination，growth and biochemical indices of different treatments in Hulthemia berberifolia

3 討論

鹽脅迫對種子萌發以及植物生長發育有抑制作用，鹽生植物能夠在一定程度的鹽脅迫下保持其萌發能力，而當鹽的濃度超過植物可承受的臨界值時，植物的萌發率急劇下降[23]。本研究發現隨著鹽脅迫強度的增加，單葉薔薇的萌發率出現明顯的下降趨勢，且在NaCl的濃度為100 mmol·L-1時顯著抑制，Chen等在棉花耐鹽性的研究中也報道了類似的結果[24]，我們推測該現象發生的原因是由于種子受到鹽脅迫后，Na+滲透積累導致原先Na+與Ca2+競爭的平衡被打破，Ca2+信號調節的功能受到抑制，產生離子應力，鹽脅迫下產生的毒性累積，從而導致萌發率的下降。Tanveer等發現濃度為100 mmol·L-1的NaCl對番茄的萌發率有明顯抑制作用，施加10 mmol· L-1的CaCl2后萌發率有所改善[25]。我們得到了類似的結論，在本研究中當NaCl的濃度為100 mmol·L-1和150 mmol·L-1時，外源鈣的施加對單葉薔薇種子的萌發率有明顯的提升作用，且CaCl2濃度為10 mmol·L-1時對萌發率的影響最明顯，效果優于20 mmol·L-1，該結果可能是由于Ca2+通過增強抗氧化酶的活力和離子穩態系統進而提高植物耐鹽的能力。NaCl的濃度為50 mmol·L-1時，外源CaCl2的施加未對種子的萌發率造成顯著影響，反而降低了種子的萌發率，我們推測該結果可能是由于在低濃度鹽脅迫下施加外源鈣反而對種子的萌發起到抑制作用。

研究表明，植物的根和莖會受到鹽脅迫的影響，根和莖的長度可以作為評價鹽害合理的指標，其中根系生長比莖生長更容易受到鹽害[26]。本研究發現，當NaCl的濃度為100 mmol·L-1和150 mmol·L-1時，施加外源鈣對單葉薔薇幼苗根莖所受到的鹽脅迫有緩解作用，根對于外源鈣的敏感程度大于莖，且CaCl2的濃度為10 mmol·L-1時緩解效果最好。Mulaudzi等人的研究表明鹽脅迫下施加外源鈣增加了高粱幼苗根莖的長度，且低濃度的鈣對鹽脅迫的改善作用更加明顯[27]，我們得出相類似的研究結果。我們推測這可能是由于鹽脅迫下植物根系外部水勢改變，導致離子水平的失衡，根系生長受到抑制，植株獲取養分以及水分運輸的能力受到阻礙，進而影響單葉薔薇莖的生長；而鹽脅迫下Na+與Cl-的累積對Ca2+產生抑制作用，植株的生長發育產生受到顯著影響，外源CaCl2的施加有利于恢復Na+與Ca2+之間的離子平衡，進而緩解鹽脅迫的危害。

Fv/Fm是光系統Ⅱ(PSⅡ)最大光化學量子效率，是PSⅡ光能最大利用效的直接體現。而光的實際量子(YⅡ)反映了光照下PSⅡ反應中心部分關閉時的實際光吸收效率以及PSⅡ反應中心的開啟程度，其值可以直接體現光合能力的強弱[28]。楊玉平等人的研究表明，非生物脅迫會對植物的光合系統結構造成損傷，而熒光葉綠素參數的變化能夠間接的判斷其損傷的程度[29]。研究結果表明正常情況下單葉薔薇幼苗的Fv/Fm約為740，Fv/Fm及YⅡ在受到鹽脅迫后顯著降低，Helena等人的研究同樣顯示在100，200和300·L-1的NaCl濃度下，芝麻菜的最大光化學量子效率顯著降低[30]。這可能由于鹽脅迫破壞光反應中心，產生有毒物質、降低光合酶活性以及葉綠體的損傷有關。研究結果發現經外源鈣處理后的單葉薔薇幼苗Fv/Fm以及YⅡ值上升，緩解了鹽脅迫對單葉薔薇幼苗光合能力的損傷。王靜靜等人的研究顯示中度鹽脅迫下施加適宜濃度的外源鈣能夠提升沙拐棗的最大光化學效率[31]，我們得出類似的結果。Nomura等的研究表明Ca2+轉運蛋白在植物外部脅迫因子的反應中起到重要作用，其相關的受體則存在于葉綠體中[32]；我們推測外源鈣的施加提升了Ca2+的濃度，增強了信號轉導的能力，在鹽脅迫下起到積極的調控作用，進而減緩了鹽脅迫對葉綠體的損傷。

光合作用是植物生長發育中非常重要的過程，但對鹽分的含量高度敏感，高濃度的鹽分會導致植物光合作用的產量降低。類胡蘿卜素作為一種抗氧化劑，能夠對光合系統進行保護，光合色素含量的變化是植物所面臨的環境的一種對策，也是用來評估植物耐鹽性的一項重要指標[33]。本研究發現，隨著鹽脅迫強度的增加，單葉薔薇幼苗的光合能力受到影響，光合色素的含量呈下降的趨勢，這也與Hoang等關于鹽脅迫對紅莧菜光合色素含量影響的研究結果相類似[34]。這一結果出現的原因可能是由于鹽脅迫，單葉薔薇幼苗活性氧含量增加造成葉綠素酶的激活，葉綠素的降解以及葉綠素a和b含量的減少，葉綠體受到損傷而導致的。Ashraf等的研究結果表明外源鈣的施加對鹽脅迫下綠豆光合系統的損傷起到一定的緩解作用[35]。本研究的結論顯示施加外源鈣顯著提升單葉薔薇幼苗中葉綠素總含量及類胡蘿卜素含量。這可能與Ca2+對維持細胞膜的穩定性起著重要的作用有關，外源鈣的施加加強了葉綠體細胞膜的穩定性，避免其被葉綠素酶降解，從而提升了光合色素的含量。

當植物處于鹽脅迫的狀態下，會產生活性氧對植物造成傷害，而作用于活性氧的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)的活性并非與活性氧的含量呈線性相關[23]。本研究表明，當鹽濃度上升時，POD、SOD和CAT的活性逐漸上升，在NaCl為100 mmol·L-1時抗氧化酶的活性最高，隨著NaCl濃度繼續上升，POD、SOD和CAT的活性呈現下降的趨勢。該結果可能是由于高濃度的鹽抑制了抗氧化酶的活性，從而造成H2O2累積。Abbas等人的研究表明外源鈣在緩解鹽脅迫的過程中通過維持POD和CAT的活性來緩解ROS損傷[36]。我們的結果同樣表明當NaCl的濃度為100 mmol·L-1和150 mmol·L-1時，施加外源鈣后POD、SOD和CAT的活性有明顯的提升，且CaCl2的濃度為10 mmol·L-1時效果最為明顯。前人的研究表明，外源鈣能夠增強質膜ATP酶活性以及提升細胞的排鈉能力[37]。我們認為外源鈣對抗氧化酶活力的影響是由于在鹽脅迫下外源鈣的施加提升了細胞的排鈉能力，Na+的毒性降低，抗氧化酶活性上升。在鹽脅迫下，細胞內活性氧的含量會上升，產生過量的H2O2對組織細胞造成損害，甚至導致細胞死亡。本研究發現隨著鹽脅迫強度的增加，單葉薔薇幼苗內過氧化氫的含量顯著上升，Ren等發現鹽脅迫下小白菜內H2O2含量顯著上升，這一現象與我們的研究結果相類似[38]。鹽脅迫下施加外源鈣后單葉薔薇幼苗內H2O2的含量顯著降低，這一結果可能是由于施加外源鈣后細胞內抗氧化酶的活性上升進而將細胞內的H2O2還原成水，從而降低對細胞的侵害。

4 結論

本研究表明，鹽脅迫抑制單葉薔薇的種子萌發、幼苗生長，施加適宜濃度的外源鈣能夠緩解鹽脅迫所造成的傷害，鹽脅迫下施加適宜濃度的外源鈣可以提升單葉薔薇種子的萌發率，促進了幼苗根和莖生長，增加單葉薔薇幼苗內光合色素以及光合指標Fv/Fm、YⅡ的含量，顯著提高抗氧化酶的水平，進而緩解鹽脅迫對單葉薔薇的傷害。在對單葉薔薇不產生抑制作用以及毒性的前提下，外源CaCl2的最適濃度為10 mmol·L-1。本研究闡述了外源鈣在鹽脅迫下的積極作用，有助于單葉薔薇資源的開發及保護。