性早熟兒童腸道菌群結構特征分析

田佳梅 王鎖英 金勝利 劉 歡 王信超 邊高瑞

性早熟指女童8歲前，男童9歲前出現第二性特征的發育，或女童10歲前出現月經初潮，女孩的發生率是男孩的5～10倍[1]。隨著社會經濟發展及國民生活水平的提高，家庭對兒童身心健康及生長發育的關注度在逐年增加，其中對于兒童性早熟的關注度增加較為明顯，性早熟的危害不僅在于影響兒童成年身高，且身體心理的不平衡發展容易引起心理障礙，使得青少年危險行為的發生率增加。近年來，兒童性早熟的發生率呈逐年上升趨勢，同時發現肥胖兒童中性早熟的發生率較體重指數(body mass index, BMI)正常兒童高，其體重每增加1kg，初潮年齡提前13天，這提示肥胖與性早熟的發生可能存在聯系，肥胖可能是性早熟發生的重要因素之一[2，3]。

自全球人類元基因組啟動計劃至今，隨著對人體腸道菌群功能探索的不斷深入研究發現，人類腸道菌群具有強大的物質能量代謝功能與機體健康密切相關，被稱為人體的第九大系統。已有研究發現，腸道菌群結構的改變可能直接或間接地導致肥胖、糖尿病等內分泌疾病。本研究應用16S rRNA高通量測序的方法，分析了解性早熟兒童腸道菌群的結構特征，對比分析性早熟兒童、肥胖兒童及BMI正常兒童腸道菌群異同，分析性早熟兒童臨床指標與腸道菌群之間的相關性，進而探尋腸道菌群與性早熟發生之間的關系，并探討性早熟與肥胖之間可能的相互關系。

對象與方法

1.研究對象及分組:選擇2018年9月～2019年10月因發現乳房增大就診于江蘇大學附屬醫院兒科的性早熟兒童19例，并按照臨床路徑完成性激素激發試驗等相關檢驗，按照中樞性性早熟診斷與治療共識確診為中樞性性早熟，患兒年齡7.50±0.95歲，選擇已于筆者醫院確診為中樞性性早熟14例，患兒年齡8.47±0.63歲，接受曲普瑞林治療1.59±0.60年，作為性早熟治療后組。同期于筆者醫院門診體檢的單純性肥胖兒童15例，患兒年齡7.20±1.35歲，BMI正常健康兒童19例，年齡7.24±0.34歲。性早熟組兒童排除垂體、下丘腦及腎上腺等器官疾病導致的繼發性性早熟，符合特發性中樞性性早熟特征，所有兒童排除其他遺傳、代謝、內分泌系統及中樞神經系統疾病，要求近1個月內無抗生素使用史，無腸道益生菌服用史[1]。研究經筆者醫院醫學倫理學委員會批準，患兒監護人均知情同意。

2.糞便的采集：采集研究對象新鮮糞便于5ml滅菌干燥離心管中，封口后即放入-80℃冰箱保存。

3.糞便16S rRNA 測序：利用QIAamp?DNA Stool Mini Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)提取樣本的基因組DNA，用Onedrop儀器和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取2.5ng稀釋后的基因組DNA作為模板，使用帶有Barcode的16S V4通用引物(515F-806R)，用GoTaq?Hot Start Colorless Master Mix高效高保真酶(美國Promega公司)進行PCR。

使用Pico Green熒光定量檢測PCR產物濃度，根據產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后用QIAquick?PCR凈化裝置試劑盒(美國Qiagen公司)純化回收產物并開始第2輪擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，擴增產物用Pico Green熒光定量以及Agilent 2200 TapeStation電泳工作平臺檢測，合格后上機測序。

采用Illumina MiSeq測序平臺(美國Illumina公司)得到下機數據，并對該數據進行預處理，根據Barcode的信息，將單個樣品原始數據拆分，取出引物序列，進行測序序列質量控制，通過質量檢查的序列，應用核糖體數據庫項目(Ribosomal Database Project，RDP) Classifier 2.3，使用Silva數據庫進行序列比對，確定每條序列的分類等級；應用Mothur以序列相似性97%為標準進行分類操作單元(operational taxonomic units，OTUs)劃分，并按序列數量生成OTUs豐富度譜。

結 果

1.各組兒童腸道菌群Alpha多樣性結果分析:Alpha多樣性是反映特定區域內生物群落豐富度和均勻度的綜合指標。Ace指數及Chao1指數代表微生物群落豐富度，這兩者數值越高說明菌群豐富度越高；Shannon指數及Simpson指數代表一定區域內微生物群落的多樣性，Shannon指數值越高，表明群落的多樣性越高，Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低。性早熟治療前組Ace指數及Chao1指數較性早熟治療后及對照組明顯下降(P<0.05)，而與肥胖比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而Shannon指數及Simpson指數在各組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

2.各組兒童腸道菌群門水平差異性分析:在腸道菌群門水平，所有樣本以擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門及疣微菌門為主要菌門，包含所有樣本豐富度99.08%的菌。門水平分布結果顯示性早熟治療前、后組及肥胖組擬桿菌門豐富度較對照組明顯升高(P<0.05)，而厚壁桿菌門及放線菌門豐富度明顯降低(P<0.05)，而此3組間擬桿菌門、厚壁桿菌門及放線菌門豐富度比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組相比較，疣微菌門豐富度在性早熟治療前、后組明顯下降，而性早熟治療后組較治療前組明顯上升(P<0.05)；變形菌門在各組之間變化比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖1，表2。

圖1 各組兒童腸道菌群門水平分布

表2 各組腸道菌群門水平比較[M(Q1，Q3)]

3.各組兒童腸道菌群屬水平差異性分析:腸道菌群屬水平檢測出前50個優勢菌屬，豐富度占所有菌屬的97.06%，所有樣本的菌群均由這50個菌屬及少量其他菌屬構成。分析發現性早熟治療前、后組及肥胖組擬桿菌屬、糞桿菌屬、普氏菌屬、另枝菌屬等菌屬豐富度均較對照組兒童高(P<0.05)，而雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、布勞特菌屬及黃曲霉菌屬明顯下降(P<0.05)；與性早熟治療后比較，性早熟治療前兒童腸道內布勞特菌屬豐富度較低，而帕拉桿菌屬豐富度增高(P<0.05)，詳見圖2、表3。

表3 各組兒童腸道菌群屬水平優勢菌比較[M(Q1，Q3)]

圖2 各組兒童腸道菌群屬水平分布

4.各組兒童腸道菌屬PCA分析:各組兒童腸道菌群PCA分析顯示性早熟治療前、后組及肥胖組各樣本點之間距離較小，提示此3組兒童腸道菌群差異相對小，而此3組與對照組各樣本點之間距離較大，提示其與對照組兒童腸道菌群比較，差異有統計學意義，詳見圖3。

圖3 主成分分析橫坐標為第一主成分，28.63%為第一主成分對樣品差異的貢獻值；縱坐標為第二主成分，10.88%為第二主成分對樣品差異的貢獻值；圖中的每個點表示1個樣品

5.各組兒童飲食結構特征：制訂統一調查問卷，對納入研究的兒童日常飲食習慣情況進行統計分析，結果顯示，性早熟組兒童飲食偏肉食、服用滋補品、兒童飲料食用概率均較對照組兒童高(P<0.05)，與性早熟組類似(P>0.05)；性早熟組在反季水果方面概率明顯高于肥胖組及對照組(P<0.05)；在喜食油炸食品的概率方面，3組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表4。

表4 各組兒童飲食結構比較[n(%)]

討 論

下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonadal，HPG)的啟動為青春期開始最直接的因素。研究發現，HPG在青春期啟動之前，因下丘腦及垂體對性激素水平較為敏感而處于靜止或者抑制狀態，隨著機體的發育，這種敏感度逐漸下降，HPG內分泌活動逐漸增強，使性腺器官的發育逐漸趨于成熟[4]。性早熟的發生則為HPG的提前啟動，研究顯示，脂肪組織的囤積可能是青春期啟動的因素之一，同時性早熟兒童中肥胖兒童占多數，且本研究中性早熟組肥胖或超重者占54.55%，與此前結果一致[1,3]。研究發現，肥胖人群腸道菌群中擬桿菌門豐富度明顯增高，而雙歧桿菌等腸道益生菌明顯減少，肥胖的發生可能與腸道菌群結構紊亂有關[5,6]。處于青春發育階段的兒童各方面均處于快速生長階段，此時期兒童腸道菌群的結構特征值得研究，其作用不可被忽視。

本實驗利用16S rRNA高通量測序的方式，研究分析了性早熟、肥胖及BMI正常的健康兒童腸道菌群的結構后發現，未經治療性早熟兒童腸道菌群的多樣性明顯低于正常兒童,而與肥胖兒童對比差異無統計學意義，經治療后的性早熟兒童腸道菌群豐富性及多樣性明顯升高。據文獻報道，腸道菌群豐富度較低的個體體內脂肪含量相對較多，且多數出現胰島素抵抗，且出現糖尿病等肥胖相關疾病的風險更高[7]。結合本研究，未經治療性早熟及肥胖兒童腸道菌群豐富度的降低可能促進其體內脂肪囤積，據此亦可解釋為何脂肪累積可能是青春期啟動的重要信號之一。

分析各組兒童腸道菌群門水平分布發現，性早熟治療前、后組及肥胖組較正常組兒童腸道具有更為豐富的擬桿菌門，而厚壁菌門及放線菌門豐富度相對較低，此3組間這三大菌門豐富度變化比較，差異無統計學意義，這是否進一步提示性早熟的發生可能與兒童肥胖有關？且肥胖組擬桿菌門及厚壁菌門變化趨勢與先前研究一致[5,8]。目前對肥胖個體腸道菌群的研究多集中于動物模型，研究發現肥胖小鼠糞便中擬桿菌門的數量減少而厚壁菌門數量增多，結果與人糞便研究結果存在差異，這還需大量研究來解釋腸道菌群與肥胖及相關內分泌疾病的關系[9]。本研究中性早熟治療前、后組疣微菌門豐富度明顯下降，且治療前組下降更明顯，疣微菌門豐富度可否用來預測性早熟的發生？性激素水平是否會影響疣微菌門豐富度？通過何種途徑影響？還需要大量研究來探究其中關系，為研究腸道菌群與性早熟發生之間的關系提供一個研究方向。

生理條件下，腸上皮細胞與細菌壁的脂磷壁酸之間形成一層生物屏障來維護腸道內環境的穩態。研究發現，腸道局部及全身長期處于低度炎性狀態為肥胖及相關代謝性疾病發生的一個重要因素，腸道菌群結構的改變使腸生物屏障受損，腸道細菌及內毒素等移位后激活免疫系統產生炎性反應。雙歧桿菌及乳桿菌等腸道有益菌在維持腸道微生態及酶的平衡方面具有重要作用。本研究進一步分析各組兒童腸道菌群屬水平結構后發現，性早熟組雙歧桿菌及乳桿菌屬等腸道有益菌屬豐富度明顯降低，擬桿菌屬及糞桿菌屬豐富度明顯升高，提示性早熟兒童腸道菌膜群的構成可能發生改變，腸生物屏障可能受損。此外，普氏菌屬、普雷沃菌屬及帕拉桿菌屬豐富度于性早熟組明顯增高，而毛螺菌屬及布勞特菌屬豐富度下降明顯。Hjorth等[10]研究發現，普雷沃菌屬及帕拉桿菌屬與腸道物質代謝密切相關，給予普雷沃菌屬與擬桿菌屬比值(prevotella/bacteroides，P/B)不同的個體相同高纖維飲食24周后發現，P/B比值高的個體體重減輕更多，而本研究中性早熟及肥胖兒童P/B比值明顯低于對照組，提示性早熟及肥胖兒童能量代謝可能較BMI正常兒童慢。

針對毛螺菌屬的研究發現，毛螺菌屬可增加腸道對病原體的抵抗性，本研究中性早熟及肥胖組兒童此菌屬豐富度明顯下降，提示性早熟及肥胖兒童腸道生物屏障的抗性下降，毛螺菌屬豐富度的下降可能是腸道慢性炎癥的產生的因素之一[11]。布勞特菌屬具有抗炎效應，且與糞便中的炎性細胞因子水平相關，在肥胖兒童及有胰島素抵抗的兒童的糞便中表現更明顯[12]。脂肪組織的囤積可增加胰島素抵抗，肥胖個體胰島素抵抗更明顯，高水平的胰島素通過增加芳香化酶活性促進睪酮轉化為雌激素，使雌激素水平增高，促進青春期啟動及發育，本研究中性早熟組及肥胖組布勞特菌屬豐富度均明顯下降，可能與其體內脂肪組織含量有關[13,14]。那么，毛螺菌屬及布勞特菌屬可否作為一種生物學標志物來監測兒童腸道炎癥程度，從而達到預防性早熟的目的。另枝桿菌屬豐富度在性早熟組明顯高于肥胖組及正常兒童，且與雌激素水平呈正相關，是否可以通過監測兒童腸道另枝桿菌豐富度來達到預防性早熟發生的可能？

通過對各組兒童飲食習慣的調查研究發現，性早熟及肥胖兒童在飲食偏肉類、常服用滋補品及兒童飲料食用方面概率明顯高于對照組，而此兩組間比較，差異無統計學意義。Jansen等[15]針對456例女童的飲食情況及月經初潮年齡相關的一項前瞻性研究發現，每周食用紅肉4次的女孩月經初潮提前的概率是每周食用2次女孩的1.64倍。研究發現，長期高膳食纖維飲食可明顯增加有益菌豐富度[16]。一項針對我國成都市9～15歲的調查研究發現，每天攝入較高膳食纖維的兒童及青少年，其青春期發育相對較晚[17]。這些研究均提示飲食習慣影響健康并可能影響腸道菌群結構，那么是否可通過增加富含膳食纖維及維生素的蔬菜等植物類食物的攝入量，來達到控制體重的目的，遠期的達到預防及控制性早熟等相關內分泌疾病的目的。

隨著腸道菌群研究的深入，微生態制劑也逐漸豐富起來，益生菌、益生元、合生元及后生素已經廣泛應用于醫療、保健等行業。其中益生菌在兒科的應用較為廣泛，如雙歧桿菌、布拉酵母菌等，但較多為短期的小劑量應用于腹瀉及便秘等消化系統疾病的學齡前兒童，調節腸道菌群的作用有限。本實驗通過對性早熟及肥胖兒童腸道菌群的研究發現其腸道菌群結構出現明顯改變，雙歧桿菌及乳桿菌等腸道益生菌豐富度明顯下降，那么是否可以利用益生菌的占位效應，通過長期小劑量補充腸道益生菌，來調節菌群結構，修補腸道生物屏障，形成一定的定植抗力，來阻止致病菌的侵入并減少腸黏膜受損。疣微菌門及另枝桿菌屬等菌屬是否可以作為生物學標志物來監測腸道炎癥程度及預測性早熟發生可能性。這為將來探討腸道菌群紊亂導致兒童性早熟及肥胖提供研究思路，同時也為早期干預治療兒童性早熟及肥胖提供思路。