不同靜水壓力對大鼠髁突軟骨細胞FAS蛋白表達的影響

張紅妤 孫 芳 肖 朋

1 新疆醫科大學第七附屬醫院口腔科，新疆烏魯木齊市 830028； 2 新疆醫科大學第六附屬醫院口腔科

髁突軟骨是骨化成骨的鑰匙，是形成髁狀突骨質的先決條件，研究髁突軟骨在壓力作用下的凋亡變化有助于解釋髁突病變的機理。本課題擬研究髁突軟骨細胞在一定的壓力和時間范圍內的凋亡情況，總結髁突軟骨細胞在一定壓力條件下的凋亡變化規律，分析臨床中常見的關節盤移位以及正畸、修復治療對髁突受力情況的影響，為臨床如何促進髁突合理受力和避免髁突不良受力提供一些啟示。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 磷酸酶抑制劑(碧云天)，RIPA裂解液(碧云天)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，SDS上樣緩沖液(Amresco，國藥集團化學試劑有限公司)，30%丙烯酰胺(Amresco)，TG[Biosharp，西格瑪奧(上海)貿易有限公司]，蛋白marker(14～120kD，北京全氏金生物技術有限公司)，PVDF膜(0.45μM，Millipore)，兔抗GAPDH 37kD(杭州賢至生物有限公司)，兔抗FAS 48kD(Santa Cruz)，HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，ECL底物液(Thermo)，X光膠片(柯達)，顯影定影試劑盒(武漢巴菲爾生物)。

1.2 細胞來源及分組、處理 取大鼠髁突軟骨細胞第三代細胞[6]，首先按照加壓時間分為1h、2h、4h三組，然后每組內按靜水壓力0kPa、6kPa、8kPa、10kPa、20kPa、30kPa隨機分成6組，共計18組，其中0kPa為對照組，其余為實驗組。分別按照相對應的實驗壓力條件和時間條件對各組進行加壓處理，處理完畢后收集細胞備檢。

1.3 加壓設備及壓力值 參考Koyama Y、Kunii R、Xiao E等[7-9]的壓力值及加壓方法，自制充氣式加壓裝置。即向培養瓶內注入空氣至壓力表指針達到指定壓強，立即移入培養孵箱并計時。

1.4 凋亡蛋白檢測 以Western Blot法檢測細胞FAS蛋白表達量。

1.4.1 制備蛋白樣品。先提取單層貼壁細胞總蛋白，10倍稀釋樣品蛋白，制定BSA標準蛋白濃度，用DG-3022A酶標儀測定OD568。再根據BSA標準品和對應的OD值可計算出直線回歸方程，根據樣品蛋白OD值，通過回歸方程測定蛋白樣品的濃度。最后沸水浴10min使樣品蛋白變性。

1.4.2 電泳及電轉移。先配制電泳膠，再將樣品蛋白和蛋白marker滴入上樣孔，各樣品總蛋白量為40μg，行電泳分離。最后以FAS-200mA 120min的轉膜條件開始電轉移。

1.4.3 免疫印跡顯色：ECL顯色系統。先將PVDF膜置于TBST溶液中，室溫搖床封閉2h。用封閉液按 1∶200稀釋一抗，浸泡PVDF膜過夜后洗去多余一抗。用封閉液按1∶50 000稀釋相應的HRP標記羊抗兔二抗，浸泡PVDF膜2h后洗去多余二抗。滴入ECL試劑使PVDF膜顯色，X 光膠片壓片后常規沖洗膠片。

1.4.4 結果與分析。晾干膠片并掃描，用BandScan行灰度值分析，以抗大鼠GAPDH作為內參，FAS/GAPDH作為蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組FAS蛋白表達量 各組FAS蛋白表達量見表1。在同一時間分組內，隨著靜水壓力的增加，FAS蛋白表達量呈先降低后上升的趨勢；當靜水壓力為6kPa、8kPa、10kPa，實驗組的FAS蛋白表達量均低于0kPa，差異有統計學意義(P<0.05)；當靜水壓力為30kPa時，不同時間分組的FAS蛋白量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；但在20kPa/1h、20kPa/2h分組時，實驗組的蛋白量與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。蛋白表達條帶圖見圖1。

表1 不同時間不同壓力值下MCCs的FAS/GAPDH蛋白表達情況比較

2.2 不同時間條件下細胞凋亡蛋白隨壓力變化情況 當壓力在0～20kPa時，細胞凋亡水平基本呈先降低后逐漸回升至原始水平，細胞在此壓力范圍內表現為抑制凋亡，當壓力在20～30kPa時，細胞凋亡程度則呈現為隨壓力和時間增加逐漸增長，表現為促進凋亡。見圖2。

2.3 不同壓力條件下細胞凋亡蛋白隨時間變化情況 在受壓時間1～2h內，壓力值為10kPa時對細胞凋亡的抑制程度最大，在受壓時間2～4h內，在30kPa、4h條件下促細胞凋亡作用最大。見圖3。

3 討論

適當的力學刺激是髁狀突終生保持改建能力的生物學基礎，對髁突軟骨細胞的生物學反應意義十分重大。適度的力學刺激對保持正常的解剖結構、生理功能是必需的[10]。正常狀態下的髁突軟骨能夠接受適當強度的壓力，假若壓力過大或時間過長，則可損傷關節軟骨，受損程度與壓力的強度、方式及受壓時間有關[11]。顳下頜關節結構功能復雜，在臨床中關節自身病變及正畸、修復治療等都會對顳下頜關節髁突的受力造成影響。

關節盤移位是TMD中一種常見的關節結構紊亂性疾病，其臨床患病率較高[12]。鄒冰爽[13]通過對比觀察面部不對稱患者雙側顳下頜關節盤情況發現，有髁突發育障礙的偏斜側關節盤形態和功能存在不同程度變化，前下移位者明顯偏多，顯示髁突發育不良的原因與關節盤移位有一定關系。另有學者[14-16]則報道不可復性盤前移位能妨礙關節盤正常活動，使髁突前斜面受壓，破壞髁突骨質。韓建輝等[17]認為不可復性關節盤前移位患者患病時間越長，開口度越大，出現骨關節病可能性也越大。開口度越大，患者越用力張口，關節盤對髁突的壓力越大，髁突受壓更加嚴重。這一點也符合本研究總結的壓力作用下軟骨細胞凋亡的規律，即長時間較大壓力作用下，細胞凋亡會增加，不利于髁突骨質改建。雖然目前沒有學者明確報道不可復性關節盤擠壓髁突的詳細壓力值，但推測這種擠壓產生的壓力值可能在20kPa以上。另外這種擠壓產生的壓力大小，可能會受到關節盤移位程度、移位方向、關節盤質地及關節囊松弛狀態等諸多因素的影響，臨床檢測難度較大。這一點提示我們，在臨床中應及早采取適當治療措施，避免髁突受長時間擠壓，尤其是在髁突表面軟骨細胞層明顯的生長發育階段。

牙齒重度磨耗是老年口腔問題中的一種常見病，存在牙齒重度磨耗的老年患者中有部分存在明顯的顳下頜關節紊亂病癥狀，但在咬合重建后患者顳下頜關節紊亂病的臨床癥狀得到了明顯好轉[21]。牙齒重度磨耗后，髁突的位置發生了相應的調整，髁突向后上移位，關節后上間隙均較小[22-23]。患者出現顳下頜關節紊亂病癥狀的原因可能與髁突與其后上部位的軟組織相互擠壓有關，但目前未見牙齒重度磨耗與髁突骨質破壞之間存在明顯相關性的報道。可能與老年人群中髁突表面以硬化皮質骨為主，軟骨細胞少，壓力對骨質影響較小有關。但髁突與其后上方軟組織之間的互相擠壓可能會引發炎癥或刺激雙板區感覺神經引發一系列臨床癥狀。所以，從壓力對細胞凋亡影響的規律來看，對重度磨耗患者及時進行咬合重建的修復治療有利于髁突骨質的健康。

深覆頜患者常有口腔不良習慣，例如緊咬牙、夜磨牙等，常導致顳下頜關節區的骨質改變。多數學者認為其原因與關節內壓力有關，Mori等[24]研究表明長時間壓力作用下使顳下頜關節功能性過載，與關節退行性病變的發生有關。因此，對于深覆頜患者，破除口腔不良習慣對于顳下頜關節的保護至關重要。

FAS途徑是軟骨細胞凋亡的途徑之一，FAS基因也是公認的凋亡活化基因，在凋亡活化階段中發揮著重要作用，FAS及配體在髁突軟骨細胞中的高表達，從而使FAS表達量成為檢測細胞凋亡的指標之一[25]。本研究以檢測FAS蛋白表達來反映軟骨細胞凋亡的變化情況，雖然可能不能完全說明細胞凋亡的真實情況，具有一定片面性，但也足以說明一定問題。

綜上所述，本研究所揭示的一定范圍壓力條件下細胞凋亡變化的規律可以較好地解釋以上臨床中常見的髁突受力改變而引起的骨質變化問題，為顳下頜關節髁突病變的機制提供了一些理論支持，為臨床中如何從髁突受力因素避免髁突發生病變提供了一些啟示。