藍蛤酶解液美拉德反應工藝優化及其對揮發性風味物質的影響

步營，韓夢琳,2，祝倫偉，朱文慧*，李學鵬*，位正鵬，勵建榮

(1.渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2.大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034；3.畢節市農業區劃中心，貴州 畢節 551700；4.榮成泰祥食品股份有限公司 農業部冷凍調理海洋食品加工重點實驗室，山東 榮成 246309)

藍蛤(Aloididaealoidi)是一種盛產于我國沿海灘涂的小型低值貝類，主要作為對蝦養殖的活餌料使用[1]。其肉質鮮美，富含優質蛋白，呈味氨基酸占氨基酸總量的50%左右，是生產海鮮調味料的理想原料[2]。近年來，以提取[3]、發酵[4]和酶解[5]等方式生產的海鮮調味料需求持續增長，其營養價值高、口感好、抗氧化性強、降膽固醇效果好[6]。其中酶解技術是一種實現海鮮調味料現代化生產的重要手段，但是酶解液一般苦腥味重、鮮味醇厚味較弱等問題嚴重限制將其開發為海鮮調味料的進程。在適宜的反應條件下，美拉德反應能產生一系列芳香物質，形成顯著的香氣并增強味覺[7]。

前期研究表明，超高壓處理通過提高蛋白酶活性、破壞蛋白質結構來增加蛋白水解度，促進了呈味氨基酸、核苷酸、有機酸等風味物質的釋放，改善了酶解液的風味[8]。本研究在前期研究的基礎上，以藍蛤超高壓酶解液為研究對象，對美拉德反應進行工藝優化，以期對藍蛤酶解液進行風味修飾，研發一種風味良好、天然營養、具有生物活性的海鮮調味料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

鮮活藍蛤：購于錦州林西路水產市場，購回實驗室后進行吐沙處理并置于-40 ℃條件下保存待用。

FlavourzymeTM(500 LAPU/g)、NovozymTM11039(1.2 AU-A/g)：丹麥Novozymes公司；氫氧化鈉(食品級)：濱化集團股份有限公司；D-木糖(食品級)：山東福田藥業有限公司；L-半胱氨酸(食品級)：河北華陽生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設備

UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津公司；PEN3電子鼻 德國Airsense公司；Agilent 7890N-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍蛤酶解液的制備

按照步營等[9]的方法進行酶解液的制備：將藍蛤脫殼取肉，取藍蛤肉加入去離子水(1∶1, W/V)后均質，分別添加FlavourzymeTM500MG(0.2%, W/V, 500 LAPU/g)和NovozymTM11039(0.2%, W/V, 1.2 AU-A/g)，用1.0 mol/L的NaOH溶液調pH為7.0，在250 MPa下高壓處理1 h，置于50 ℃水浴鍋中酶解4 h，酶解結束后100 ℃下滅活10 min。在4 ℃下以5120×g離心15 min，將上清液冷凍干燥后得到凍干粉，置于干燥器中備用。超高壓處理所得凍干粉記為F1(超高壓酶解物)；常壓處理所得凍干粉記為F2(常壓酶解物)。

1.3.2 美拉德反應單因素試驗

以凍干粉(0.50 g)、D-木糖(0.20 g)和L-半胱氨酸(0.20 g)為原料，配制成10 mL的反應體系。以感官評價、風味中間體、電子鼻為指標來探究反應溫度、反應時間以及初始反應pH值對美拉德反應產物的影響。

1.3.2.1 反應溫度對美拉德反應產物的影響

取上述反應體系，調pH為6.5，分別在90，100，110，120，130 ℃下加熱70 min，冷卻至室溫后進行評價。

1.3.2.2 反應時間對美拉德反應產物的影響

取上述反應體系，調pH為6.5，在110 ℃下分別加熱60，70，80，90，100 min，冷卻至室溫后進行評價。

1.3.2.3 初始反應pH值對美拉德反應產物的影響

取上述反應體系，調pH為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，分別在110 ℃下加熱70 min，冷卻至室溫后進行評價。

1.3.3 美拉德反應正交試驗

在單因素試驗基礎上，每個因素確定3個水平，以感官評分為試驗指標，設計L9(34)正交試驗優化各因素組合，以確定美拉德反應的最佳工藝參數。各因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.3.4 低分子量風味中間體的測定

美拉德反應產物中低分子量風味中間體在波長294 nm處有最大吸收峰，A294nm越大風味越佳。用去離子水將美拉德反應產物稀釋50倍后在294 nm處測定吸光度，重復3次。

1.3.5 感官評價

本試驗挑選10名受過培訓的食品專業人員(男女各半)組成感官評價小組，評價指標用腥味、肉香味、鮮味、苦味等來表示，對美拉德反應產物逐個進行評分，最終得出感官綜合評分[10]，見表2。

表2 美拉德反應產物的感官評價標準Table 2 The sensory evaluation criteria for MRPs

1.3.6 電子鼻的測定

不同傳感器性能描述見表3。

表3 電子鼻傳感器性能描述Table 3 The performance description of electronic nose sensors

參照步營等[11]的方法稍作修改。移取5 mL美拉德反應產物于20 mL測試管中，用3層保鮮膜封口，50 ℃水浴30 min，生成頂空氣體，有利于電子鼻探頭吸取頂端空氣。電子鼻參數設置：以潔凈干燥空氣為載氣，測定時間120 s，氣體流量300 mL/min，采樣后清洗時間240 s，重復3次。

1.3.7 美拉德反應產物的制備

以最優反應條件，將F1和F2的美拉德反應產物分別記為MRPF1和MRPF2，未添加D-木糖和L-半胱氨酸的熱反應產物作為陰性對照(F1NC和F2NC)，未加熱反應作為空白對照(F1BC和F2BC)。

1.3.8 揮發性物質測定

采用HS-SPME-GC-MS法對樣品中的揮發性化合物進行測定[12]，參照步營等的方法稍作修改。取5 mL樣品于20 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl和磁轉子，迅速用聚四氟乙烯隔墊密封。60 ℃磁力攪拌加熱平衡15 min后，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(280 ℃活化30 min)頂空吸附30 min，將萃取頭插入氣相色譜進樣口，解吸5 min。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流模式進樣；程序升溫：柱初溫40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。

質譜條件：電離方式為電子轟擊(EI源)，電子能量為70 eV；色譜-質譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍30～550(m/z)。

所得GC-MS檢測結果通過計算機NIST11譜庫和人工檢索處理，并利用C8～C20正構烷烴混標的保留時間計算各個色譜峰的保留指數(RI)，計算方式參照Xu等[13]的方法，確定揮發性物質的化學組成，統計匹配度大于60和RI偏差<20的揮發性物質，按峰面積歸一化法計算各化學成分的相對含量。

1.3.9 數據分析

采用SPSS Statistics 19.0分析軟件中的ANOVA程序進行顯著性分析(P<0.05，表明差異顯著)，數據繪圖采用Origin 9軟件。電子鼻數據通過自帶的WinMuster軟件進行主成分分析(principal component analysis, PCA)。

2 結果與討論

2.1 美拉德反應單因素條件的確定

2.1.1 美拉德反應溫度的確定

反應溫度對美拉德反應的影響見圖1。

圖1 反應溫度對美拉德反應的影響Fig.1 The effect of reaction temperature on Maillard reaction

由圖1可知，當溫度低于110 ℃時，美拉德反應不能充分進行，所得產物腥味較重，影響感官品質。隨著反應溫度升高，美拉德反應產物的腥味明顯減弱，并產生濃郁的肉香味和醇厚味，感官品質在120 ℃時達到最佳(7.8分)，顯著高于其他反應溫度下的感官評分(P<0.05)。當反應溫度繼續升高時，由于溫度過高而產生焦糊味和苦味，嚴重影響感官。研究表明，當反應溫度過高時會產生羥甲基糠醛和丙烯酰胺等對人體有害的物質[14]；隨著反應溫度的升高，美拉德反應產物的A294nm呈遞增趨勢，即有利于美拉德反應的進行，該結果與孫世廣[15]和伊小麗[16]的研究結果一致。綜合來看，選擇120 ℃為最佳反應溫度進行后續試驗。

不同反應溫度的美拉德反應產物電子鼻響應值雷達圖見圖2中(a)，其中除傳感器W1W(對硫化物靈敏)以外，其他的傳感器對各組美拉德反應產物均有明顯的響應，且不同反應溫度的響應值存在差異。

由圖2中(a)可知，隨著反應溫度的升高，W5S的響應值明顯降低，W5C顯著升高，說明醛類等氮氧化合物逐漸減少，并產生芳香類物質。該結果與感官評價時的結果相一致；為進一步分析不同反應溫度下美拉德反應產物風味的區別，對其進行PCA分析，其結果見圖2中(b)。

圖2 不同反應溫度的美拉德產物的電子鼻響應值雷達圖(a)和主成分分析圖(b)Fig.2 Electronic nose response value radar diagram (a) and principal component analysis diagram (b) of Maillard reaction products at different reaction temperatures

由圖2中(b)可知，PC1為90.56%，PC2為8.32%，貢獻率總和為98.88%，說明可代表樣品揮發性風味的主要特征。從空間分布上看，除了反應溫度為90 ℃和100 ℃的美拉德反應產物氣味略有重疊，其他區分度良好，說明樣品間的氣味存在差異。發生重疊的原因可能是反應溫度較低，導致美拉德反應產物氣味相似。

2.1.2 美拉德反應時間的確定

反應時間對美拉德反應的影響見圖3。

圖3 反應時間對美拉德反應的影響Fig.3 The effect of reaction time on Maillard reaction

由圖3可知，隨著反應時間的延長，美拉德反應產物的感官評分呈遞增趨勢。當反應時間為60 min和70 min時，美拉德反應產物有腥味和苦澀感，無明顯肉香味，且感官協調性較差。隨著反應時間延長至90 min，美拉德反應產物的腥味減弱，苦澀味無明顯變化，肉香味明顯，整體協調性更佳。反應時間為100 min與90 min的感官評分無顯著差異(P>0.05)。綜合來看，選擇100 min為最佳反應時間進行后續試驗。

圖4 不同反應時間的美拉德產物的電子鼻響應值雷達圖(a)和主成分分析(b)Fig.4 Electronic nose response value radar diagram (a) and principal component analysis diagram (b) of Maillard reaction procucts at different reaction time

不同反應時間的美拉德反應產物電子鼻響應值雷達圖見圖4中(a)。除傳感器W1W外，其他的傳感器對各組美拉德反應產物均有明顯的響應，變化趨勢與上述反應溫度的影響效果一致，但變化幅度低于溫度的影響。

由圖4中(b)可知，PC1為80.88%，PC2為11.92%，貢獻率總和為92.80%，能較好地代表美拉德反應產物中揮發性風味的主要特征。從空間分布上看，反應時間為70，80，90 min的美拉德反應產物相互重疊，可能是該反應時間段內樣品的變化程度小，三者氣味成分相似度高。

2.1.3 美拉德反應初始pH的確定

圖5 pH值對美拉德反應的影響Fig.5 The effect of pH value on Maillard reaction

美拉德反應體系的初始pH能夠影響美拉德反應的進行，pH值過低或過高都會使產物產生不愉快的感官印象。由圖5可知，美拉德反應產物的感官評分和A294 nm隨著pH的變化先增大后減小。當反應液為酸性時，美拉德反應產物的增香效果不明顯。原因可能是在酸性環境下氨基被質子化，主要發生1,2-稀醇化反應，生成糠醛等物質[17]，而具有良好風味的物質較少。pH為7.0時美拉德反應產物的評分最高，此時A294 nm最大，即低分子質量風味中間體最多。隨著pH變為堿性，反應變得劇烈且不易控制，感官評分和A294 nm開始降低，因此選擇pH 7.0為最佳初始pH進行后續試驗。

不同反應pH值的美拉德反應產物電子鼻響應值雷達圖見圖6中(a)。

由圖6中(a)可知，與反應溫度和時間相比，不同pH值的響應值均較小，并且強度變化微小，這表明當pH在6.0～8.0范圍內變化時，對美拉德反應產物的氣味方面影響較小，結合感官評價分析可知，pH變化主要影響了美拉德反應產物的滋味。

由圖6中(b)可知，PC1為99.21%，PC2為0.44%，貢獻率總和為99.65%，能代表樣品揮發性風味的主要特征。每組樣品測定數據均能成團并且形狀圓整，表明試驗重復性良好。同時各組樣品在空間分布上距離較為緊密，表明樣品間氣味差別較小。

圖6 不同反應pH值的美拉德產物電子鼻響應值雷達圖(a)和主成分分析(b)Fig.6 Electronic nose response value radar diagram (a) and principal component analysis diagram (b) of Maillard reaction products at different reaction pH values

2.2 美拉德反應正交試驗結果

表4 正交試驗設計結果Table 4 The design results of orthogonal test

由表4可知，影響藍蛤酶解液美拉德反應產物感官品質的因素主次順序依次為A>B>C，即反應溫度>反應時間>初始pH值。比較均值k的大小可以得出美拉德反應條件的最佳組合為A2B1C2，即反應溫度為120 ℃，時間為90 min，初始pH為7.0，在此條件下制備的美拉德反應產物無腥味并且肉香味濃郁，整體協調性好(感官評分為8.5)。

2.3 揮發性物質分析

表5 氣相色譜-質譜法檢測美拉德反應后酶解產物揮發性成分的變化Table 5 Changes of volatile compounds of enzymatic hydrolysate after Maillard reaction detected by GC-MS

續 表

續 表

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在一定程度上，樣品的風味特征取決于揮發性化合物的組成和含量。由表5可知，根據它們的一般性質和化學結構，共鑒定出139種揮發性化合物并將其分為11個類別，包括醛類、酮類、醇類、芳香族化合物、酯類、酸類、酚類、烴類、呋喃類、含硫化合物、含氮化合物。

醛類主要是由不飽和脂肪酸氧化或氨基酸降解產生的，一般具有水果、青草、脂肪和腥味氣味特征，并且具有較低的氣味活性值(odour activity value, OAV)，因此即使微量也能表現出其獨特的風味。在本研究中，醛類是酶解液最主要的揮發性化合物，而其他研究也表明醛類是水產品中最主要的風味物質[18-19]。空白對照組中醛類的相對含量(F1BC:30.32%,F2BC:21.69%)高于陰性對照組(F1NC:27.95%,F2NC:22.66%)和美拉德反應產物(MRPF1:1.80%,MRPF2:1.17%)。該結果表明，隨著美拉德反應的進行，醛類的相對含量明顯下降，這與Zhao等的研究一致。

總共檢測出16種酮，它們有脂肪和堅果的良好風味。但是，酮類的相對含量較低并且具有高氣味閾值，因此對風味貢獻較小。醇類主要來源于多不飽和脂肪酸的降解或羰基化合物的還原，一般來講，由于醇類的感官閾值高，風味貢獻較小。1-辛烯-3-醇是不飽和醇，由于其OAV低，因此對樣品風味有較大貢獻。一些研究發現，1-辛烯-3-醇廣泛存在于貝類中，是貝類的特征風味物質[20]。芳香族化合物主要是通過芳香族氨基酸的分解代謝產生。此外，還發現了一些酯類、酸類、烴類和酚類物質，由于其OAV較高，通常對樣品的風味沒有影響。

共檢出13種呋喃化合物，有研究表明，呋喃是氨基酸熱降解而形成的[21]。呋喃類及其衍生物可貢獻出肉味、咖啡味和焦香味等香味，并且因極低的OAV而顯著影響食品的風味。呋喃類物質在F1BC、F2BC、F1NC、F2NC、MRPF1、MRPF2中的相對含量分別為0.78%、0.22%、9.67%、5.02%、32.61%、22.93%。這些結果表明，加熱美拉德反應后呋喃含量明顯增加，反應體系中L-半胱氨酸和D-木糖的加入促進了呋喃的形成。

共檢測到18種含硫化合物，是提供肉香味、燒烤味和牛肉風味的重要風味物質，其呈味特性好且OAV低。由表5可知，美拉德反應前含硫化合物的相對含量低于0.21%，而反應后其種類和相對含量明顯增大(大于6.82%)。此外，還檢出13種含氮化合物，它們是引起熟食烘焙、花生、牛肉、可可味的揮發性物質，具有極低的氣味閾值。在本研究中，美拉德反應后F1中含氮化合物的相對含量從0.00%增加到6.26%，這是熱誘導的碳水化合物降解產物和氨基酸的Strecker產物之間反應導致的。

3 結論

本文以藍蛤超高壓酶解液為原料，采用美拉德反應對酶解液的風味進行改良。在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗設計對反應的各個條件進行優化試驗。結果表明，反應溫度對酶解液氣味的改變影響最大，電子鼻技術能良好地將其區分。最優工藝條件為反應溫度120 ℃、時間90 min、初始pH 7.0，在此條件下制備的美拉德反應產物無腥味并且肉香味濃郁，整體協調性好。此外，HS-SPME-GC-MS結果表明，酶解液的揮發性化合物在美拉德反應前后發生變化，具有腥味特征的醛類明顯降低，具有肉香味的呋喃和含硫化合物含量增加。由此可見，藍蛤超高壓酶解液通過美拉德反應可以明顯地改善其風味。