miR-143靶向作用于TFF3抑制前列腺癌細胞PC3的增殖

郭 亮，肖 峻，陶 陶

前列腺癌(prostate cancer, PC)是男性最常見的惡性疾病，發病率為3/10 000。由于世界老年化人口不斷增加，預計到2030年，PC患者將超過170萬，新增死亡人數約為49.9萬[1]。目前，分子靶向治療已成為腫瘤研究的熱點。然后，針對已知的PC基因靶點的治療沒有獲得滿意的效果[2]。因此，尋找更有效的分子靶點是當前研究PC靶向治療的重要任務之一。microRNAs(miRNAs)是一類小的非編碼RNA分子，參與調節多種生物學過程，如細胞周期、細胞凋亡、器官發育、組織再生、衰老，也參與PC的發病機制。已有研究[3]證實miR-143在PC組織的表達水平低于癌旁組織，表明miR-143與PC存在聯系。但對于miR-143在PC發生發展中的分子機制，目前還不清楚。該研究中分析了PC細胞株PC3中miR-143的表達水平，并通過慢病毒建立穩定轉染miR-143的PC3細胞，分析miR-143對PC3細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移的影響。利用生物信息學分析miR-143的潛在靶基因，并使用熒光素酶報告基因系統進行驗證。以期為尋找更有效的PC治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人PC3細胞購自武漢中國典型培養物保藏中心；胎牛血清、RPMI-1640培養基、青鏈霉素液、胰蛋白酶-EDTA消化液和Lipofectamine 3000均購自美國Thermo Fisher公司；細胞培養箱、TRIzol reagent購自美國賽默飛公司；miScript II RT Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；Gene Pharma Hairpin-itTMmicroRNA RT-PCR Quantitation Kit購自上海吉瑪基因公司；聚凝胺、嘌呤霉素、CCK-8檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒購自上海Beyotime Biotechnology公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國Promega公司；攜帶has-miR-143及其對照(miR-NC)的慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；包含TFF3 3′-UTR的野生型(WT-pGL3-TFF3)、突變型(Mut-pGL3-TFF3)熒光素酶報告基因質粒和真核表達質粒(pCNDA3.1-TFF3)購自滁州通用生物技術有限公司；miR-143 mimic及對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司。ABI StepOne Plus系統購自美國Applied Biosystems公司；細胞培養箱和NanoDropTM1000微量分光光度計購自美國賽默飛公司；酶標儀購自美國 Biotek公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人PC3細胞使用含10%FBS和1×青鏈霉素液的RPMI-1640培養基，培養于37 ℃含5% CO2的培養箱中。

1.2.2穩定轉染細胞株的建立和實驗分組 慢病毒感染在24孔板中進行，每孔接種5×104個PC3細胞，培養16 h。用含10%FBS的RPMI-1640培養基稀釋慢病毒，同時加入終濃度為10 mg/L的聚凝胺，每孔加入2 ml稀釋的病毒液使得感染復數(multiplicity of infection, MOI)為20，于37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續培養24 h，隨后換成新鮮培養基繼續培養72 h，換成含嘌呤霉素的培養基持續培養2周，篩選出穩定表達miR-143的PC3細胞，記為PC3/miR-143組，同時篩選出感染對照慢病毒的PC3細胞，記為PC3/miR-NC組，在熒光顯微鏡下觀察細胞是否表達綠色熒光，通過Real-time PCR檢測細胞中miR-143的表達水平。以未轉染的PC3細胞記為PC3組。使用Lipofectamine 3000將pCNDA3.1和pCNDA3.1-TFF3質粒分別轉染PC3/miR-143組的細胞，分別記為PC3/miR-143+ pCDNA3.1組和PC3/miR-143+ pCDNA3.1-TFF3組，轉染操作步驟按照說明書進行。

1.2.3RNA提取和Real-time PCR 細胞中的總RNA通過TRIzol reagent提取，提取過程參考說明書進行?？俁NA的純度和含量通過NanoDropTM1000分光光度計檢測和計算260 nm與280 nm處吸光度值的比值，以及260 nm與230 nm處吸光度值的比值來評價。使用 miScript II RT Kit將總RNA轉錄成cDNA，將1 μg總RNA加入到含12 μl DEPC處理水、2 μl miScript Reverse Transcriptase Mix、2 μl miScript Nucleics Mix和4 μl 5× miScript HiSpec buffer中，在37 ℃孵育60 min后，95 ℃孵育5 min，終止反應，凍存于-20 ℃備用。對于miR-143的表達水平檢測使用Gene Pharma Hairpin-itTMmicroRNA RT-PCR Quantitation Kit在ABI StepOne Plus系統上進行，反應條件：95 ℃、10 min為預變性階段條件；95 ℃、12 s，62 ℃、40 s，共40個循環。以U6作為內參，2-ΔΔCt法計算miR-143的相對表達量。對于TFF3 mRNA的定量檢測同樣在ABI StepOne Plus系統上進行，反應條件為95 ℃、10 min預變性；95 ℃、5 s，60 ℃、40 s，共40個循環。以GAPDH作為內參，2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。擴增使用的引物為TFF3 (genbank登錄號: NM_003226)，(F)5′-CCAAGCAAACAATCCAGAGCA-3′，(R)5′-GCTCAGGACTCGCTTCATGG-3′；U6 snRNA (genbank登錄號: NR_004394)，(F)5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，(R)5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH，(F)5′-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3′，(R)5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

1.2.4細胞增殖活力檢測 使用CCK-8試劑盒對不同組細胞的增殖情況進行分析。將處于對數生長期的各組細胞用胰酶消化后用未添加血清的培養基重懸，按照100 μl/孔(2 000個細胞)接種96孔板，饑餓培養12 h后更換完全培養基繼續培養，于培養0、24、48、72、96 h時每孔分別加入10 μl CCK-8溶液，孵育1 h后通過酶標儀檢測吸光度(A450)值。每組細胞進行6復孔檢測。

1.2.5細胞凋亡檢測 細胞凋亡分析通過AnnexinV-FITC Analysis Kit在流式細胞儀上進行，操作按照說明書進行。具體為各組細胞在相同的條件下培養48 h后用胰酶消化，2 555 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。取5～10萬重懸的細胞，2 555 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μl Annexin V-FITC Binding buffer重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，室溫避光孵育15 min，避光置于冰浴中，立即進行檢測，使用Cell Quest software分析結果。

1.2.6生物信息學分析 從Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 數據庫中獲得2個分析PC中miRNA表達水平的數據集(GSE64333和GSE54516)，分析PC組織和癌旁組織中miR-143的表達水平。分別使用在線分析軟件miRanda (http://www.microrna.org/)、PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/)和TargetScan7.1(http://www.targetscan.org/)預測 TFF3 3′-UTR中miR-143的結合位點，取三者的交集，構建熒光素酶報告基因質粒進行實驗驗證。

1.2.7雙螢光素酶報告基因分析 分析miR-143與TFF3 3′-UTR的相互作用，構建野生型和突變型TFF3 3′-UTR熒光素酶報告基因質粒pGL3-TFF3，以及預測與miR-143結合區域點突變的熒光素酶報告基因質粒Mut-pGL3-TFF3。將熒光素酶報告基因質粒、內參質粒(海腎素熒光)和miR-143同時轉染HEK293細胞。48 h后根據雙熒光素酶報告基因檢測系統的說明書操作裂解細胞，加入發光液后在多功能酶標儀上檢測結果。利用海腎素熒光作為內參照對結果進行均一化處理。

2 結果

2.1 miR-143在PC組織中表達水平對GEO數據庫中數據集GSE64333和GSE54516分析顯示，與癌旁組織相比，PC組織中miR-143的表達降低(P<0.000 1)。見圖1。

圖1 miR-143在PC和癌旁組織中表達水平分析A：數據集GSE64333中miR-143的表達水平；B：數據集GSE54516中miR-143的表達水平;與癌旁組織比較：****P<0.000 1

2.2 miR-143在不同細胞中的過表達通過熒光顯微鏡觀察顯示，在PC3/miR-143組和PC3/miR-NC組中均存在明顯的綠色熒光，而在PC3組中未觀察到熒光信號。Real-time PCR檢測顯示PC3/miR-143組中miR-143的表達量高于PC3組(t=8.877,P=0.000 9)和感染對照慢病毒的PC3組(t=8.358,P=0.001 1)。見圖2。

圖2 miR-143在PC3細胞中過表達的鑒定A：熒光顯微鏡觀察不同組細胞中EGFP的表達 ×200；B：Real-time PCR檢測不同組細胞中miR-143的表達水平；1：PC3組；2：PC3/miR-NC組；3：PC3/miR-143組；與PC3/miR-143組比較：**P<0.01

2.3 miR-143對PC3細胞增殖的影響通過CCK-8法檢測各組細胞0～96 h增殖情況，結果表明，從48 h開始，與PC3組相比，PC3/miR-143組的增殖能力明顯下降(F=167.8，P=0.009 5)；PC3/miR-NC組增殖能力未見改變。提示miR-143能抑制PC3細胞的增殖，見圖3。

圖3 miR-143對抑制PC3細胞增殖的影響與PC3組比較：*P<0.05；與PC3/miR-NC組比較：##P<0.01

2.4 miR-143對PC3細胞凋亡的影響流式細胞分析PC3組、PC3/miR-NC組和PC3/miR-143組的凋亡比例分別是(3.6%±0.5%)、(3.2%±0.7%)和(10.4%±1.7%)。PC3/miR-143細胞的凋亡比例高于PC3組(t=6.647,P=0.003)和PC3/miR-NC組(t=6.783,P=0.003)。提示miR-143在PC3細胞中具有促進細胞凋亡的作用。見圖4。

圖4 流式細胞術檢測miR-143對PC3細胞凋亡的影響1：PC3組；2：PC3/miR-NC組；3：PC3/miR-143組

2.5 miR-143靶向作用于TFF3 3′-UTR抑制TFF3的表達情況生物信息學軟件分析顯示miR-143與TFF3的3′-UTR存在結合位點(圖5A)；雙熒光素酶報告基因分析顯示，miR-143能夠靶向作用于TFF3的3′-UTR抑制其表達，當對TFF3的3′-UTR中結合位點進行點突變處理后，miR-143的抑制作用消失(圖5B、C)。Real-time PCR檢測的結果顯示，在過表達miR-143的PC3/miR-143組，TFF3的表達水平低于PC3組(t=6.417,P=0.002)和PC3/miR-NC組(t=6.322,P=0.002)(圖5D)。

圖5 miR-143靶向作用于TFF3 3′-UTR對TFF3表達的影響A：在線分析軟件預測TFF3 3′-UTR中miR-143的結合位點；B：pGL3-TFF3和Mut-pGL3-TFF3熒光素酶報告基因質粒構建的示意圖；C：雙熒光素酶報告基因分析miR-143與TFF3 3′-UTR的靶向作用；D：Real-time PCR檢測在PC3細胞中轉染miR-143對TFF3 mRNA的表達水平的影響；與miR-143組比較：**P<0.01

2.6 TFF3抵消miR-143對PC3細胞增殖的抑制作用在PC3/miR-143組中轉染TFF3真核表達質粒，通過CCK-8法檢測各組細胞0～96 h增殖情況，結果顯示，轉染TFF3后PC3/miR-143組的增殖能力明顯增加(F=120.9，P=0.008 7)，見圖6。

圖6 轉染TFF3后miR-143對抑制PC3細胞增殖的影響與PC3/miR-143組比較：*P<0.05；與PC3/miR-143+pCDNA3.1組比較：##P<0.01

2.7 TFF3抵消miR-143對PC3細胞凋亡的促進作用流式細胞技術分析PC3組、PC3/miR-143組、PC3/miR-143+pCDNA3.1組和PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3組的凋亡比例分別是(4.6%±0.6%)、(11.2%±1.1 %)、(12.1%±1.5%)和(5.1%±1.2%)。PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3組的凋亡比例低于PC3/miR-143+pCDNA3.1組(t=7.244,P=0.001 9)和PC3/miR-143組(t=5.549,P=0.005 2)。提示TFF3能夠抵消miR-143的促凋亡作用。見圖7。

圖7 流式細胞術檢測TFF3對PPC3/miR-143細胞凋亡的影響1：PC3組；2：PC3/miR-143組；3：PC3/miR-143+pCDNA3.1組；4：PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3組

3 討論

近十年來，越來越多的研究[4]證明miRNA在癌癥的發展和進展中起著重要作用。miRNA表達水平異常與PC的發生有關，miR-9-5p能夠抑制PC的增殖[5]，而miR-34a能夠促進PC的轉移[6]。在砷誘導獲得癌表型的前列腺干細胞中，有幾種miRNA的表達水平發生改變，其中miR-143的表達水平下降最明顯[7]。提示miR-143參與了PC的發生，但其分子機制還不是很清楚。該研究對GEO數據庫中關于PC miRNA表達水平的數據集GSE64333和GSE54516分析也表明，PC組織中miR-143的表達下降。本研究分析了PC3細胞中miR-143的作用，在PC3細胞中轉染miR-143 mimics能夠抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。生物信息學分析顯示，miR-143可能靶向作用于TFF3基因的3′-UTR，抑制其表達。在本研究中Real-time PCR和Western blot的結果均顯示在PC3中穩定表達miR-143能夠抑制TFF3 mRNA和蛋白的表達。

TFF3是一種分泌肽，主要在胃腸道黏膜上皮中表達，參與腸道黏膜損傷后修復。除了參與黏膜修復外，TFF3還參與腫瘤細胞的侵襲轉移和抗凋亡信號的激活。在乳腺癌[8]、胃癌[9]、胰腺癌[10]、結直腸癌[11]和PC[12]中均觀察到TFF3的表達異常增加。Garraway et al[13]均報告TFF3在PC組織中高于正常前列腺組織(分別為42%vs10%和47%vs18.8%)，提示TFF3是PC的生物標志物。在PC細胞中過表達TFF3能夠促進細胞增殖、侵襲和轉移。本研究表明miR-143在PC3中表達降低，TFF3在PC3中表達增加。先前的研究提示在多種腫瘤中miR-143的表達水平均下降。在鼻咽癌中miR-143能夠靶向作用于FMNL1，抑制腫瘤轉移[14]；在骨肉瘤中miR-143能夠靶向作用于FOSL2，抑制其肺轉移[15]。一項研究[16]顯示，在PC中，姜黃素能夠上調miR-143的表達，抑制腫瘤的發生發展；此外，在去勢治療抵抗的PC細胞中下調TFF3的表達能夠抑制細胞侵襲。另一項研究[17]顯示，在PC細胞中下調TFF3的表達能夠抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，增加放療敏感性。本研究在穩定表達miR-143的PC3細胞中轉染TFF3真核表達質粒，能夠抵消miR-143的作用，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。上述結果表明在PC中miR-143可能通過靶向抑制TFF3的表達，發揮抑癌作用。

綜上所述，該研究表明，在PC3細胞中過表達miR-143能夠下調TFF3表達，發揮抑制PC細胞增殖作用；提示miR-143和TFF3基因是治療PC的潛在靶點。后期還需要進行臨床和體內實驗，進一步明確miR-143和TFF3基因在PC中的作用機制。