紅景天苷抑制內質網應激和細胞凋亡減輕心臟缺血再灌注損傷

曹旭東，張 帆，黃明月，陳 軍，陳國安，陳小林

急性心肌梗死是全世界范圍內危害人類健康的主要因素[1-2]。再灌注能降低心肌梗死患者病死率，但缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)損傷的存在，使患者仍有發展為心力衰竭的風險[3]。研究[4-5]表明，IR損傷的機制包括氧自由基、鈣超載、細胞凋亡、壞死、自噬及內皮細胞功能障礙等。紅景天苷(salidroside, Sal)是從紅景天中提取的生物活性成分[6]。Sal具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老及神經和心血管保護作用[6-7]。內質網在蛋白質、脂質合成和鈣調控中發揮作用。當內質網穩態被破壞時，會出現錯誤折疊和未折疊蛋白質堆積，觸發內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[8]。ERS與多種心血管疾病有關，如心肌肥大、缺血性心臟病和心力衰竭[9-11]。因此，為了更好地探討心肌IR損傷的機制并尋找潛在的保護藥物，該研究采用大鼠離體心臟IR模型，觀察Sal在IR損傷中的作用以及對細胞凋亡和ERS的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只8周齡SPF級雄性SD大鼠購買于南方科技大學實驗動物中心，體質量280 g左右。在標準環境下飼養，所有操作均嚴格遵循實驗動物使用規范和要求。

1.2 主要試劑Sal(根據相關文獻[12]確定其藥物濃度)、氯化三苯基四氮唑(TTC)購買于美國Sigma公司；RIPA購買于上海碧云天生物技術有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒購買于南京建成科技有限公司；TUNEL染色試劑盒購買于瑞士Roche公司；B淋巴細胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)及蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X, Bax)、轉錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和轉錄活化因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和GAPDH抗體購買于美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗鼠和山羊抗兔二抗購買于武漢proteintech公司。心臟灌注液組分和含量(mmol/L)如下: KCl 4.6，KH2PO41.2，NaCl 120，NaHCO325，CaCl21.5，MgSO41.2，Glucose 11。先用95% O2/5% CO2的混合氣向灌注液中通氣30 min再開始實驗，灌注液pH值7.35～7.45，溫度37 ℃。

1.3 離體心臟模型和實驗分組大鼠腹腔注射水合氯醛(10%, 0.3 ml/100 g)和肝素(500 U/kg)，麻醉后開胸，游離心臟后放入預冷的灌注液中，并將心臟轉移至Langendorff灌流管口，用手術線固定。灌注液由主動脈口逆行灌注心臟，灌注壓保持10.67 kPa。將含有液體的球囊經二尖瓣插入左心室，通過Labchart 7軟件記錄左室收縮峰壓(left ventricular peak systolic pressure, LVSP)和左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)。將各組心臟LVEDP調為0.67 kPa，使心臟穩定10 min。待其平衡后，隨機分為4組(n=12)：對照(Control)組、Sal處理(Sal)組、缺血再灌注(IR)組和Sal處理缺血再灌注(IR+Sal)組。Control組,正常灌注150 min；Sal組,先用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注10 min，再用正常灌注液灌注140 min；IR組,缺血30 min，再灌注120 min；IR+Sal組，用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注1 min，缺血30 min，再用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注9 min，最后恢復灌注液灌注110 min。

1.4 心臟功能檢測用Labchart 7軟件實時監測左心室內壓力的變化，實驗過程中記錄LVSP和LVEDP變化。LVSP、LVEDP代表心臟收縮、舒張功能。

1.5 心肌梗死面積檢測實驗結束后將心臟取下放入-80 ℃冰箱2 h，沿心尖到心底部的縱軸方向將心臟連續切成2 mm厚的薄片，每個心臟均選擇第5片放入盛有2% TTC溶液的24孔板中，37 ℃避光水浴15 min；將染色完的心肌薄片用4%多聚甲醛避光浸泡2 d；數碼相機拍照，死亡心肌組織呈白色，存活心肌組織呈紅色，Image J測量白色區面積和心臟總面積。心臟梗死面積分數=(白色區面積/總面積)×100 %。

1.6 LDH活性檢測按照LDH試劑盒說明書操作，收集缺血心臟復灌前10 min的灌注液，而Control組、Sal組心臟收集穩定灌注1 h后10 min內的灌注液。采用分光光度計讀取各組灌注液的吸光度值并計算LDH活性。

1.7 TUNEL染色再灌注結束后，將心臟浸泡在4%多聚甲醛中固定；采用常規脫水、石蠟包埋和切片，并根據TUNEL染色試劑盒說明書處理標本，全程避光；激光共聚焦顯微鏡下觀察染色情況，每張切片隨機選取10個高倍視野，TUNEL陽性細胞的細胞核呈綠色，DAPI染核使細胞核均呈藍色；TUNEL陽性率=綠色細胞核數/總細胞核數。

1.8 Western blot法檢測蛋白表達再灌注結束后，快速將心臟凍存于-80 ℃冰箱備用。各組心臟稱取相同質量的心肌組織，按照質量/體積比1 ∶4加入含蛋白酶抑制劑和RIPA的裂解液，冰上研磨并裂解30 min，放入4 ℃離心機，6 970 r/min離心20 min，取上清液分裝，BCA法蛋白定量；配制SDS-PAGE膠，每孔加30 g蛋白，常規電泳和濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉120 min，將切好的條帶分別與Bcl-2 (1 ∶1 000)、Bax (1 ∶1 000)、CHOP (1 ∶1 000)、PERK (1 ∶1 000)、ATF6 (1 ∶1 000)和GAPDH (1 ∶5 000)抗體孵育，4 ℃過夜；第2天，1×TBST室溫洗膜3次，每次10 min，用山羊抗鼠和山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育120 min，1×TBST室溫洗膜3次，每次10 min；利用Bio-Rad發光儀和ECL顯色液檢測，Image J分析軟件進行灰度值分析，GAPDH作為內參。

1.9 統計學處理使用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，實驗結果用均數±標準差表示，各組間差異比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組之間的比較采用Tukey檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Sal提高大鼠離體心臟IR后LVSP并降低LVEDP大鼠離體心臟左心室壓力統計結果顯示，Control組和Sal組LVSP和LVEDP差異無統計學意義；與Control組比較，IR組LVSP降低，而LVEDP升高(F=194.6，P<0.001)，差異有統計學意義；與IR組比較，IR+Sal組LVSP升高，而LVEDP降低(F=185.7，P<0.001)，差異有統計學意義。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟功能的比較A：LVSP統計圖；B：LVEDP統計圖；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

2.2 Sal減輕大鼠離體心臟心肌梗死面積和灌注液中LDH活性TTC染色和LDH試劑盒檢測結果顯示，Control組與Sal組心肌梗死面積分數和LDH活性無明顯差異(P>0.05)；與Control組比較，IR組心肌梗死面積分數和LDH活性升高，差異有統計學意義(F=120，P<0.001)；與IR組比較，IR+Sal組心肌梗死面積分數和LDH活性降低，差異有統計學意義(F=444.5，P<0.001)。見圖2。

圖2 大鼠心臟梗死面積和LDH活性的比較A：心臟梗死面積圖；B：心臟梗死面積統計圖；C：LDH活性統計圖；a：Control組; b：Sal組; c：IR組; d：IR+Sal組；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

2.3 Sal抑制大鼠離體心臟心肌細胞凋亡蛋白的表達Western blot結果顯示，與Control組比較，Sal組心肌細胞抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax表達差異無統計學意義；與Control組比較，IR組心肌細胞Bcl-2表達降低，Bax表達增加(P<0.001)；而與IR組比較，IR+Sal組心肌細胞Bcl-2表達增加，Bax表達降低(F=212.2，P<0.001)。見圖3。

圖3 大鼠心肌細胞Bcl-2和Bax表達的比較A：Western blot檢測結果圖；B：Bcl-2/Bax統計圖；a：Control組; b：Sal組; c：IR組; d：IR+Sal組；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

2.4 Sal抑制大鼠離體心臟心肌細胞凋亡率TUNEL染色結果顯示，與Control組比較，Sal組心肌細胞TUNEL染色陽性細胞率差異無統計學意義(P>0.05)；與Control組比較，IR組心肌細胞TUNEL染色陽性細胞率增加(P<0.001)；而與IR組比較，IR+Sal組心肌心肌細胞TUNEL染色陽性細胞率降低(F=109.1，P<0.001)。見圖4。

圖4 大鼠心肌TUNEL陽性細胞率的比較 ×200a：Control組; b：Sal組; c：IR組; d：IR+Sal組；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

2.5 Sal抑制大鼠離體心臟心肌細胞ERS蛋白表達如圖5所示，Western blot結果顯示，與Control組比較，Sal組ERS蛋白PERK、ATF6和CHOP的表達差異無統計學意義；與Control組比較，IR組PERK、ATF6和CHOP的表達增加(F=190，P<0.001)；而與IR組比較，IR+Sal組PERK、ATF6和CHOP的表達降低(F=88.7，P<0.001)。

圖5 大鼠心肌細胞ERS相關蛋白表達的比較A：Western blot檢測結果圖；B：PERK、ATF6、CHOP相對表達量統計圖；a：Control組; b：Sal組; c：IR組; d：IR+Sal組；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

3 討論

及時重建堵塞冠脈的血流是實現挽救缺血心肌細胞和減小心肌梗死面積的最有效方法。然而，再灌注是一把“雙刃劍”，除了能提供氧氣和營養物質恢復細胞代謝并清除細胞代謝副產物外，其本身也會引起新的心肌細胞死亡，進一步加重心肌損傷[4]。到目前為止，臨床上還沒有較好的預防或治療再灌注損傷的方法和藥物。

Sal作為紅景天的重要活性成分，大量研究[6-7]證實了其在抗炎、抗氧化、清除自由基、抗衰老及神經和心血管保護中的作用。結果表明，在大鼠離體心臟IR模型中，Sal能增加LVSP，降低LVEDP，改善心臟功能；同時，Sal還能減小心肌梗死面積和LDH活性，這些結果進一步證實了Sal在心臟IR損傷中具有保護作用。而細胞凋亡是心肌IR過程中一種重要的細胞死亡方式，并且已經成為了IR損傷的一個重要病理因素[13]。在細胞凋亡過程中會出現抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少、凋亡蛋白Bax表達增加及DNA片段化現象[14]。本研究結果顯示，Sal增加離體心臟IR損傷中Bcl-2表達，降低Bax表達和TUNEL染色陽性細胞數，表明Sal可以抑制IR中發生的細胞凋亡。

ERS是由蛋白錯誤折疊、Ca2+儲存過量、氧化應激、缺血和脂質代謝紊亂等病理因素引起的，未折疊蛋白反應可以激活內質網整合膜蛋白PERK和ATF6，進而啟動ERS[8]。另外，ERS蛋白CHOP可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進凋亡蛋白Bax和Bim的表達[15]。本研究結果顯示，Sal降低IR中ERS蛋白PERK、ATF6和CHOP的表達，表明Sal能夠抑制心臟IR觸發的ERS損傷，提示Sal可能通過抑制ERS減輕心臟IR損傷。

綜上所述，Sal可以改善大鼠離體心臟功能，減小心肌梗死面積，減輕心臟IR損傷，而這一保護作用可能與抑制細胞凋亡和ERS有關。這些結果表明Sal是一種潛在的臨床防治IR損傷的藥物，并為Sal的臨床應用提供了實驗依據。