血清微小RNA-128-3p在下肢動脈硬化閉塞癥介入術后支架內再狹窄中的臨床意義

李治君,吳 松,李 成 ,馬 恩

(1.三二〇一醫院 檢驗科,陜西 漢中,723000;陜西省寶雞市中心醫院,2.檢驗科,3.血管外科,陜西 寶雞,721008)

目前，血管內介入治療已成為動脈閉塞性疾病的主要治療方法之一[1]。盡管該治療成功率較高，但仍有部分患者會受到支架內再狹窄(ISR)的困擾，這是由血管內皮損傷和內膜增生后血栓形成使得血管通暢性降低所致[2]。管腔狹窄和內膜增生均與血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖相關[3]，因此基于VSMCs遷移和增殖的分子生物學和遺傳學機制尋找有效的生物標志物對于ISR的預測和診斷是非常重要的。ISR可能還伴隨著特定微小RNA(miRNAs)的異常表達，例如微小RNA-128-3p(miR-128-3p)已被證實是炎癥和血管生成的重要調節因子，對VSMCs遷移和增殖具有顯著抑制作用[4]。但miR-128-3p與血管介入術后ISR的關系目前尚未完全闡明。本研究通過檢測血清miR-128-3p表達進一步了解其在ISR預測中的臨床價值，旨在為個體化干預下肢動脈硬化閉塞癥(LEAOD)提供更好的方案。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年3月—2021年10月曾在三二〇一醫院血管外科接受血管介入治療的406例LEAOD患者作為研究對象，男307例、女99例，年齡33～79歲，病程0.8～7.3年,Fontaine分期為Ⅱ期174例、Ⅲ期207例、Ⅳ期25例。納入標準:接受CT血管造影(CTA)檢查后確診LEAOD者;動脈脈搏減弱或消失，營養失調，下肢發涼、無力、蒼白者。排除標準:① 置入支架后拒絕接受CTA檢查者;② 未服用抗血小板聚集藥物者;③ ≥2個部位存在ISR,并在確診后1個月內接受血運重建治療者;④ 左室射血分數≤40%的嚴重左室功能障礙者;⑤ 重要器官功能不全和嚴重疾病患者，如肝功能障礙(各種致病因素對肝實質細胞和枯否細胞造成嚴重損害)、腎功能障礙(嚴重腎小球損害、體內代謝廢物排泄紊亂、水電解質和酸堿平衡紊亂)、肺功能障礙(呼吸衰竭)、腦功能障礙(腦損傷和腦震蕩)、感染(細菌、病毒和寄生蟲感染)、中毒(有機磷或有毒氣體中毒)、心血管和腦血管疾病(腦內出血、腦血栓和顱內壓升高)、腦老化以及其他功能障礙等;⑥合并結締組織疾病、自身免疫性疾病、急性心肌梗死或惡性腫瘤者。本研究經三二〇一醫院倫理委員會審核批準，確認所有研究內容均按照相關規定和指導方針進行，且納入患者均簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

介入治療開始前和治療后72 h內，采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管采集患者外周血3～5 mL,以2 000轉/min速度離心5 min,13 000轉/min離心10 min,收集上清液存放在-80 ℃環境中備用。miR-128-3p引物序列:(正向)5′-GGTCAGTGAACCGGTC-3′,(反向)5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6mRNA引物序列:(正向)5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,(反向)5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。用mirVana miRNA分離試劑盒(美國Thermo Fisher公司)從血液中提取總miRNAs,用5 μL miRNA在20 μL反應體系中進行逆轉錄。反應條件:16 ℃水浴30 min,42 ℃水浴30 min,85 ℃水浴5 min,70 ℃加熱10 min。應用Prism 7000熒光定量PCR系統(美國Thermo Fisher公司)檢測血清miR-128-3p相對表達量，反應體系20 μL,包含5 μmol/L上游引物、下游引物各0.5 μL和2 μL cDNA模板,4種dNTP共2 μL,Tag DNA聚合酶0.25 μL,10×擴增緩沖液2 μL,Mg2+(1.5 mmol/L) 1.5 μL,加ddH2O補充至20 μL。反應條件:95 ℃水浴3 min,隨后95 ℃水浴12 s加62 ℃水浴50 s,共循環40次。將U6用作內參基因。

1.3 酶聯免疫吸附測定

采用人用酶聯免疫吸附測定試劑盒(美國IBL公司)檢測血清白細胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)水平。

1.4 介入治療

根據術前CTA成像結果選擇合適的介入治療方案。如果狹窄或閉塞發生在股淺動脈中段或遠端第3段或腘動脈，則首選同側股動脈。如果狹窄或閉塞發生在股淺動脈近端第3段或髂動脈，患者需行腔內治療(包括導管直接溶栓、藥物機械性溶栓、經皮抽吸、保護性植入Greenfield濾器、球囊擴張聯合支架植入)。采用“翻山鞘”股外側動脈逆行穿刺方式進行腔內治療。穿刺結束后，局部麻醉患者，植入鞘管，行靶動脈造影，選擇治療方案。狹窄血管長度<3 cm的患者選用經皮血管腔內血管成形術(PTA)，PTA術后殘余狹窄≥30%者選用血管內支架，狹窄血管長度>10 cm或完全閉塞的患者選用動脈旋磨術。在此條件下，根據不同的手術方案，選用不同類型的導絲。PTA微球囊擴張選用ev3 NanoCross和Bantam纖維支架，支架植入選用自膨脹金屬支架(ev3 ProtegeEverFlex或BARD LifeStent XL)。介入治療成功被定義為使病變血管管腔直徑狹窄程度<30%,沒有明顯的動脈夾層或嚴重的并發癥，否則視為介入治療失敗。

1.5 隨訪及ISR判斷標準

隨訪期間對患者進行住院訪視和電話隨訪，觀察患者跛行癥狀和動脈狹窄情況。術后6個月，對患者進行CTA分析，檢測踝臂指數(ABI)。根據治療結果，將本研究納入患者分為再狹窄組和非再狹窄組。治療有效的評估標準:出院前復查CTA，符合血管內介入治療成功的判斷標準，且ABI增加，下肢間歇性跛行、休息痛等癥狀持續緩解，糜爛完全痊愈。ISR的判斷標準:符合治療有效標準，但最后一次隨訪的ABI低于治療前，CTA復查顯示支架內及支架兩端5 mm內血管腔狹窄率≥50%。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 2組患者基線特征比較

再狹窄組患者的平均年齡高于非再狹窄組，合并糖尿病、高血壓病者占比高于非再狹窄組,Fontaine分期為Ⅲ期、Ⅳ期者占比高于非再狹窄組，差異有統計學意義(P<0.05);2組患者在年齡、性別、體質量指數、病程、吸煙史、冠心病、高脂血癥、術前用藥史、術后規律用藥和術后規律運動方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 再狹窄組和非再狹窄組患者基線特征比較

2.2 2組患者血清miR-128-3p水平比較

術后，再狹窄組、非再狹窄組血清miR-128-3p水平均低于術前，差異有統計學意義(P<0.05);手術前后，再狹窄組血清miR-128-3p水平均高于非再狹窄組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者血清微小RNA-128-3p水平比較

2.3 術前血清miR-128-3p水平對ISR的預測價值

ROC曲線顯示，術前血清miR-128-3p水平預測ISR的曲線下面積為0.712(95%CI為0.644～0.781),約登指數為0.335,敏感度、特異度分別為40.5%、93.0%,見圖1。

2.4 術前血清miR-128-3p水平與LEAOD患者臨床病理特征的關系

再狹窄組中，有糖尿病史、有高血壓病史、年齡≥50歲患者的血清miR-128-3p水平分別高于無糖尿病史、無高血壓病史、年齡<50歲患者，差異有統計學意義(P<0.05),表明再狹窄組術前血清miR-128-3p水平與年齡、糖尿病史和高血壓病史顯著相關(P<0.05);再狹窄組術前血清miR-128-3p水平與性別、Fontaine分期、吸煙史、冠心病史和高脂血癥病史均無顯著相關性(P>0.05)。非再狹窄組術前血清miR-128-3p水平與年齡、性別、Fontaine分期、吸煙史及糖尿病、高血壓病、冠心病、高脂血癥病史均無顯著相關性(P>0.05)。見表3。

表3 術前血清微小RNA-128-3p水平與2組LEAOD患者臨床病理特征的關系

2.5 血管介入治療后ISR危險因素的二元Logistic回歸模型分析

二元Logistic回歸模型分析結果顯示，年齡≥50歲、Fontaine分期Ⅲ～Ⅳ期、有高血壓病史、有糖尿病史和術前血清miR-128-3p表達升高均為血管介入治療后ISR的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 血管介入治療后再狹窄危險因素的二元Logistic回歸模型分析

2.6 2組患者術前血清細胞因子水平比較

再狹窄組術前血清IL-6、IL-8、TNF-α水平高于非再狹窄組，術前血清TIMP-1水平低于非再狹窄組，差異有統計學意義(P<0.05),見表5。

表5 2組患者術前血清細胞因子水平分析[M(P25,P75)]

2.7 再狹窄組患者術前血清miR-128-3p表達與細胞因子水平的相關性

Pearson相關性分析結果顯示，術前血清miR-128-3p表達水平與血清IL-6、IL-8水平呈顯著正相關(rs=0.646、0.621,P<0.001),與TIMP-1水平呈顯著負相關(rs=-0.759,P<0.001);術前血清miR-128-3p表達水平與IL-10、IL-1β、TNF-α水平無顯著相關性(rs=-0.069、0.194、0.130,P>0.05)。

3 討 論

相關研究[5]表明，外周血管疾病患者介入治療后發生ISR的概率相對較高。學者[6-7]認為，這與血管重塑、內膜異常生長、阻礙炎癥反應的聚合物吸收、術后血管彈性回縮等因素有關。因此，探索ISR的發生機制和預測因子具有重要的臨床意義。本研究發現,miR-128-3p是ISR的一個強有力的獨立預測因子。

miRNAs是一類小的非編碼RNA,與特異性mRNAs的3′端非翻譯區(3′UTR)結合，可抑制靶基因mRNA的表達[8]。目前，在人類基因組中，上百種miRNAs已被證實在血管內皮細胞(VSMC)的增殖和遷移中起著關鍵作用[9-10]。VSMCs的異常增殖是導致外周血管疾病的主要原因，如動脈粥樣硬化、動脈再狹窄和動脈瘤[11]。目前治療阻塞性增生性血管病變的方法包括使用藥物洗脫支架，這種裝置可物理性地擴張血管腔，并釋放抗增殖藥物抑制繼發性VSMCs激活和遷移進入血管腔。然而，抗增殖藥物缺乏特異性，其對所有類型的細胞均有同樣的作用。動脈再狹窄的細胞特異性治療則利用了miRNAs的作用，其中miR-143和miR-145家族成員具有血管平滑肌表達特異性，在VSMCs表型開關的調控中起著關鍵作用[12]。但這2種miRNAs在體內其他組織中的表達水平非常高，一方面可能很難使其表達水平進一步上調至治療水平，另一方面可能會影響其對ISR風險的預測作用。miR-128-3p與miR-143、miR-145家族成員一樣，亦參與血管平滑肌增殖、血管生成等過程[13]。QU C等[14]證實,miR-128-3p通過抑制人叉頭框蛋白O4和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達而抑制VSMCs的體外增殖和遷移，并可進一步抑制小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇的表達。miR-128-3p是VSMCs的重要調節劑[4],VISTBAKKA J等[15]發現，多發性硬化癥患者循環miR-128-3p水平普遍升高，且其與運動障礙和疾病活動度存在密切聯系。本研究結果顯示，血清miR-128-3p水平升高可能與ISR發生風險相關。

既往研究的關注點主要集中在miRNAs的篩選方面，但很少關注其相應的下游靶基因水平或相關因素，而這通常不足以支持其潛在的生物標志物作用[16]。本研究發現，與非再狹窄組患者相比，再狹窄組患者的血清IL-6、IL-8、TNF-α表達水平顯著更高,TIMP-1表達水平顯著更低，且術前血清miR-128-3p表達水平與血清IL-6、IL-8水平呈顯著正相關，與TIMP-1水平呈顯著負相關。由此表明，再狹窄患者中miR-128-3p/TIMP-1/IL-6循環級聯反應的改變，與炎癥反應信號通路密切相關。進一步推測,miR-128-3p及其下游因子的變化可能參與了ISR的進展過程。眾所周知,ISR與基質金屬蛋白酶(MMPs)的激活及其內源性抑制劑(TIMPs)的下調有關，導致動脈壁基質降解和彈性降低，引起內皮炎癥和血管通透性增加[17]。榮鈺等[18]發現，血清MMP-9、TIMP-1水平對冠狀動脈ISR具有良好的診斷價值。而miR-128-3p在ISR發生期間表達增高，導致靶基因表達降低，從而限制了對MMPs活性的抑制作用。因為TIMPs對于抑制炎癥反應是必不可少的，所以TIMP-1在ISR發生過程中應該處于低水平狀態。從分子生物學角度而言,TIMP-1與IL-6、IL-8存在負相關[19-20]，IL-6、IL-8表達升高，會導致斑塊不穩定性增加[21]。在支架植入后的血管壁修復過程中,IL-6和IL-8的變化是非線性的，其僅在炎癥反應階段才起到重要作用，故IL-6、IL-8對ISR的預測效能有限。VSMCs的增殖和遷移是導致新生內膜增生的關鍵細胞事件，本研究從另一角度驗證了ISR的炎癥級聯反應，炎癥相關因子通常在循環中分布更為廣泛，本研究基于既往基礎研究結論定量檢測了ISR級聯反應的關鍵標志物，結果與既往研究高度一致。

綜上所述，血清miR-128-3p水平或可成為LEAOD患者血管介入治療后ISR的特異性生物標志物。然而，本研究為單中心研究且樣本量較少，未來還需開展多中心大樣本量研究進一步驗證miR-128-3p及其下游靶基因作為ISR實用生物標志物的臨床效能。