嘌呤能型2受體家族X7嘌呤受體高表達與可切除非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的相關性研究

杜曉丹,徐維國,朱 靜,李 琳,吳君華

(電子科技大學醫學院附屬綿陽醫院/綿陽市中心醫院 呼吸與危重癥醫學科,四川 綿陽,621000)

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，約占所有癌癥死亡人數的1/5,其中非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的病理類型[1]。由于缺乏典型的臨床癥狀及有效的早期篩查程序,NSCLC患者的5年相對生存率僅為19%[1-3]。因此，尋找簡單、靈敏、高效的生物標志物具有重要的臨床意義。三磷酸腺苷(ATP)除了作為細胞內的能量分子，還參與了細胞間信號轉導，其相關受體被稱為嘌呤能型2受體家族受體(P2Rs),由P2XR和P2YR這2個亞家族組成。P2XR是一類配體門控離子通道，由7個不同亞型組成，其中 P2X7受體(P2X7R)定位于細胞膜，具有獨特而重要的生物學功能，被認為是腫瘤侵襲和轉移的重要介質，在炎癥和有氧糖酵解中發揮重要作用[4]。因此,P2X7R可能是多種癌癥的新的生物標志物，也可能是靶向治療的新選擇[5]。本研究探討腫瘤組織P2X7R高表達對可切除NSCLC患者生存預后的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010—2015年在本院接受肺葉切除或全肺切除術的NSCLC患者120例，平均年齡(56.03±15.00)歲，收集所有患者術中腫瘤標本，其中67例組織標本包括了癌旁正常肺組織(距離手術切緣≥5 cm)。經本院電子數據中心獲取患者的臨床資料。納入標準:① 經組織病理學或細胞學診斷為NSCLC者;②由2位病理學家分別從腫瘤定位、組織病理類型、組織學分級、TNM分期等方面對患者病理資料進行了評估;③ 接受根治性手術和肺門縱隔淋巴結清掃，且術后接受輔助放療者;④ 排除術前接受新輔助化療者。組織學檢查和腫瘤細胞分化的分級依據世界衛生組織2004年修訂的分類方案和國際抗癌聯盟(UICC)的2009年TNM分期系統進行;患者生存數據是從醫院的醫療數據處理記錄中收集的;將手術日期至死亡日期的間隔時間確定為總生存期(OS)。本研究經本院倫理委員會批準，獲得所有患者的書面知情同意，并按照機構指南的規定采集組織樣本。

1.2 免疫組化法(IHC)檢測組織P2X7R表達

將使用福爾馬林固定、石蠟包埋的病理組織制成5 μm切片，在60 ℃恒溫箱內加熱1 h,然后進行IHC分析。使用二甲苯脫蠟，并在梯度乙醇中再水化，在室溫下于含3% H2O2的甲醇溶液中孵育30 min,消除內源性過氧化物酶活性;將組織切片于98 ℃下在pH值為9.0的目標修復溶液(Dako,丹麥)中孵育40 min;采用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(Dako,丹麥)洗滌數次后，將組織切片與抗P2X7抗體(ABCAM,英國,1∶100)或抗CD8抗體(ABCAM,英國,1∶250)在4 ℃下孵育過夜。與一抗孵育后，將切片組織在PBS中沖洗2次，并在室溫下與Dako Envision System HRP偶聯兔抗體孵育30 min;在PBS中洗滌組織切片，與3,3′-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)(Dako,丹麥)在室溫下孵育6～10 min顯色以用于蛋白質檢測，并用蘇木素復染1 min。采用ICH檢測P2X7R在腫瘤細胞中的表達強度和分布;采用CD8染色法評估腫瘤浸潤性淋巴細胞(TILs)密度。每個樣本的免疫染色由2位病理學專家獨立審閱。

1.3 IHC結果判斷標準

P2X7R的表達通過IHC評分進行評估，該評分是將胞漿和胞膜染色強度(0分為陰性,1分為弱染色,2分為中等染色,3分為強染色)乘以染色程度(<10%為0分,10%～<25%為1分,25%～70%為2分,>70%為3分)。IHC評分范圍為0～9分，根據既往研究[6]數據，將3分作為最佳臨界值,<3分是低P2X7R組,≥3分是高P2X7R組。評估CD8+TILs的密度:隨機選擇5個視野，首先進行半定量染色評分，分為1分(<1%)、2分(1%～<10%)、3分(10%～<33%)、4分(33%～66%)、5分(>66%);免疫反應陽性的細胞表現為胞漿和(或)質膜部分或全部陽性;染色密度分別為缺失、輕(+)、中()、強();計算得分(1～8分)，按CD8+TILs密度的平均值分為低密度組和高密度組。

1.4 隨訪預后情況

所有NSCLC患者術后每半年隨訪1次，隨訪需進行胸部增強CT，并根據需要進行腹部、頭部等部位檢查。自手術后次日開始，記錄腫瘤復發或轉移的部位及時間，隨訪日期截至2021年10月31日。

1.5 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。采用卡方檢驗分析NSCLC與癌旁正常肺組織P2X7R表達的差異，并采用卡方檢驗分析P2X7R表達與NSCLC臨床病理特征的關系。生存率采用Kaplan-Meier分析，生存率曲線的比較采用Log-rank檢驗。采用單因素和多因素Cox回歸模型分析影響NSCLC患者預后的因素。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，分析P2X7R表達診斷NSCLC及預測預后不良的曲線下面積(AUC)。P<0.05(雙側)為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 P2X7R的表達水平及其與臨床病理特征的關系

NSCLC組織中P2X7R陽性表達率為51.67%(62/120),高于癌旁正常組織中的25.37%(17/67),差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。在P2X7R表達與臨床病理特征的分析中,TNM分期Ⅲ期、淋巴結狀態N1或N2期、腫瘤直徑≥3 cm及CD8+TILs低密度的NSCLC患者的P2X7R高表達率更高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

A:P2X7R強陽性表達;B:P2X7R陰性表達;C:CD8+TILs高密度;D:CD8+TILs低密度。圖1 NSCLC組織中P2X7R及CD8+TILs的免疫組化結果

表1 NSCLC組織中P2X7R表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.2 生存曲線分析

隨訪期內復發82例(68.33%)，包括局部復發18例，遠處轉移52例，局部復發和遠處轉移12例。患者5年總生存率為43.33%(52/120)。經Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗顯示,P2X7R低表達者5年無病生存率(57.89%對比7.94%)和總生存率(66.67%對比22.22%)更高，差異有統計學意義(P<0.01),見圖2。

A:P2X7R低表達與高表達者無病生存期的比較;B:P2X7R低表達與高表達者總生存期的比較。

2.3 預后影響因素的單因素和多因素分析

經單因素分析，腫瘤直徑、NSCLC組織CD8+TILs密度及NSCLC組織P2X7R表達均是NSCLC患者5年無病生存率的預后影響因子(P<0.05),而吸煙史、TNM分期、淋巴結狀態、NSCLC組織CD8+TILs密度及NSCLC組織P2X7R表達均是NSCLC患者5年總生存率的預后影響因子(P<0.05),見表2。多因素Cox回歸分析顯示,TNM分期、吸煙史是患者總生存率的獨立預后影響因子，而NSCLC組織中P2X7R表達是影響5年無病生存率和總生存率的獨立預后影響因子(P<0.05)。見表3。

表2 單因素分析影響NSCLC患者預后不良的預后因素

表3 多因素分析NSCLC患者預后不良的影響因素

2.4 P2X7R表達預測NSCLC患者預后不良的效能

經ROC曲線分析,NSCLC組織P2X7R表達預測NSCLC患者5年復發或轉移、總生存期的AUC分別為0.850(95%CI:0.770～0.930)、0.780(95%CI:0.696～0.864),cut-off值均為2.5分，特異度分別為70.7%、73.1%,靈敏度分別為86.8%、72.1%。見圖3。

A:P2X7R表達預測5年內復發或轉移的效能;B:P2X7R表達預測5年內總生存期的效能。

3 討 論

肺癌是癌癥死亡的主要原因，約占癌癥死亡總數的19%,肺癌早期缺乏典型癥狀，大多數患者確診時已屬晚期，故很難達到有效治療。局部肺癌的5年生存率為53.2%,但在晚期和發生轉移后的生存率僅有23.7%和3.5%。因此，肺癌的早期診斷對降低患者病死率至關重要[7-10]。本研究發現NSCLC組織中的P2X7R表達顯著高于癌旁正常組織，且通過多因素Cox回歸模型和ROC曲線分析發現,P2X7R表達是影響5年無病生存率和總生存率的獨立預后影響因子,NSCLC組織中P2X7R陽性表達對患者預后不良有一定的預測效能，提示P2X7R可能參與了NSCLC的發生、發展。

P2X7R是嘌呤受體的亞型，其被發現可作為多種疾病的治療靶標。P2X7R已被證實在調節炎癥反應中發揮重要作用，幾乎所有炎癥細胞類型中都有表達，包括淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞，以促進適應性免疫和先天免疫。健康組織中細胞外ATP的含量很低，在發生組織損傷、炎癥、缺氧、缺血以及腫瘤微環境中會顯著增加，這種核苷酸通過作用于P2受體來影響癌癥和浸潤性免疫細胞反應，而定位于胞質膜的P2X7R被認為是腫瘤侵襲及轉移的重要介質，在炎癥和有氧糖酵解過程中發揮重要作用[11-14]。DE MARCHI E等[15]發現P2X7R過表達與白血病微環境中ATP水平、急性髓系白血病及對化療的反應有相關性，并且認為P2X7及其遺傳變異體可以被視為血液系統惡性腫瘤的潛在的新的生物標志物以及新的治療靶點。ZHANG Y C等[16]研究表明,P2X7激活促進PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin和mTOR/HIF1α/VEGF信號傳導，從而介導骨肉瘤細胞的促腫瘤作用，并且P2X7激動劑全身給藥誘導了骨肉瘤裸鼠的腫瘤生長、轉移和腫瘤相關的骨破壞，而P2X7拮抗劑則逆轉了這些作用。CALIK I等[6]還發現P2X7R過表達是胃癌患者預后不良的獨立影響因素,P2X7R高表達與胃癌患者的晚期TNM分期及轉移有關。本研究也發現TNM分期III期、淋巴結轉移、腫瘤直徑≥3 cm及CD8+TILs低密度的NSCLC患者的P2X7R高表達率顯著更高。研究[17]證實NSCLC患者組織中CD8+TILs高密度是有利于患者預后的標志物，表明P2X7R可能參與NSCLC疾病的進展，并可能與患者不良預后相關。

研究[18]對P2X7 mRNA與NSCLC的相關性進行了探討，發現與表現出P2X7 mRNA高表達的樣品相比,P2X7 mRNA低表達的樣品表現出更高的miR-21表達量,K-Ras突變型NSCLC患者的腫瘤樣本中觀察到顯著升高的miR-21表達，這些過程可能與腫瘤進展相關;此外，與P2X7 mRNA低表達患者相比，高表達NSCLC患者的無進展生存期和總生存期顯著更低。本研究中,P2X7R低表達者5年無病生存率和總生存率更高。吳丹等[19]認為P2X7R 高表達導致NSCLC臨床預后不佳的機制可能為:P2X7R高表達可誘導癌細胞侵襲和轉移;P2X7R可能通過影響上皮間質轉化而影響NSCLC的進展;P2X7R高表達可促進癌細胞中新生血管形成。QIN J L等[20]研究發現P2X7在巨噬細胞中高表達，并且P2X7缺乏可通過在體內和體外下調信號轉導及轉錄激活蛋白6(STAT6)和干擾素調節因子4(IRF4)磷酸化來削弱巨噬細胞的“M2樣”極化,P2X7缺乏可通過降低腫瘤細胞增殖和血管生成、促進T細胞動員和逆轉M2樣巨噬細胞極化來限制烏拉坦誘導的肺癌發生和Lewis肺癌的進展;通過P2X7抑制劑及O-ATP、A-438079鹽酸鹽和A-740003共同給藥，克服了對免疫療法[抗程序性死亡受體1(PD-1)抗體]和化學療法(順鉑)的耐藥性，證明了P2X7可能成為治療NSCLC的新靶點[21-22]。

綜上所述,NSCLC組織中P2X7R高表達是NSCLC患者預后不良的獨立預測指標，并且與TNM III期、淋巴結轉移、腫瘤生長有關。P2X7R蛋白表達與CD8+TILs腫瘤組織浸潤的負相關性亦揭示了其在調節腫瘤微環境中的重要作用，這些發現均支持P2XR7可能是理想的NSCLC預測因子和生物分子靶點。