缺氧誘導HIF?1α在子宮內膜異位癥巨噬細胞極化異常的作用及機制研究

楊如玉 梁炎春 韋雅婧 黃碧淇 楊帆 譚灝 溫磊 陸曦 牛剛

1中山大學附屬第一醫院婦產科（廣州 510080）；2中山大學中山醫學院（廣州 510089）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs，簡稱內異癥）是一種常見的婦科良性疾病，指具有生長功能子宮內膜組織（腺體和間質）出現在子宮腔以外的部位，在育齡期婦女發病率為6% ～ 10%［1］。因其生長、浸潤和反復的出血常導致患者出現疼痛、不孕等癥狀，嚴重影響患者的生活質量，給患者帶來巨大的心理和經濟壓力［2］。目前學界廣泛認可“經血逆流”是子宮內膜異位癥的發病機制，但是該學說難以完全解釋內異癥的具體發生機制。

近年來大量的研究表明，經血逆流可能只是誘因，巨噬細胞狀態和功能導致的免疫功能異常是促進內膜黏附、種植和生長的重要催化因素。有研究表明內異癥病灶中的巨噬細胞主要表現為M2 型，發揮促進子宮內膜基質細胞的增殖和侵襲的作用，在血管生成、免疫調控等方面也發揮著舉足輕重的作用［3-5］。相反，也有其他研究表明，內異癥病灶中M2 型巨噬細胞的數量減少，多數巨噬細胞向M1 型轉化［6-9］。巨噬細胞作為子宮內膜異位癥中最常見的炎癥免疫細胞，在EMs 病灶中的分布和功能狀態仍待研究，調控其表型轉變的機制仍不清楚。

越來越多的證據表明，脫落的子宮內膜碎片進入盆腹腔面臨的缺氧微環境可能是調控巨噬細胞表型轉變的重要機制。在腫瘤學領域，研究顯示缺氧可抑制巨噬細胞mTOR 活性降低和糖酵解，從而抑制M1 的分化和功能，巨噬細胞更多地表現為M2 型［10］。但也有研究認為缺氧上調RAGE的表達，激活了巨噬細胞中的NF?κB 信號，促進巨噬細胞向M1 型分化［10］。HIF?1α 作為缺氧微環境中至關重要的轉錄因子，對內異癥病灶中巨噬細胞極化狀態的調控作用仍不清楚，而且通過改善病灶缺氧微環境，恢復病灶內巨噬細胞的分布平衡，是內異癥靶向治療中很有前景的方向。因此，本研究擬探討缺氧誘導HIF?1α 調節巨噬細胞極化狀態的機制，為內異癥的發病機制研究提供新的科學依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年1月至2021年12月31日在中山大學附屬第一醫院住院并行手術治療的患者。17 例子宮內膜異位癥患者納入內異癥組，手術標本經術后病理證實為子宮內膜異位癥組織，對照組為20 例非子宮內膜異位患者，取自同期因不孕癥或者子宮肌瘤而住院治療的患者，收集在位子宮內膜標本，術后病理證實為無子宮內膜異位癥。納入標準：（1）18～45 歲女性；（2）體質量指數（BMI）：18.5 ～ 24 kg/m2；（3）患者或其法定代理人簽署書面知情同意書。排除標準：（1）妊娠期婦女、絕經后婦女；（2）合并嚴重內科疾病、免疫性疾病、惡性疾病或其他慢性炎癥疾病；（3）合并精神疾病者（包含不能配合病例收集過程和隨訪過程者）；（4）合并急性生殖道感染或盆腔慢性炎癥；（5）入院前6 個月內曾使用激素類藥物或GnRHa 治療者、手術史等。本研究經中山大學附屬第一醫院倫理委員會審批通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與材料 THP?1 細胞（人類單核細胞白血病細胞系）購買于上海中喬新舟生物科技有限公司，細胞培養胎牛血清、青霉素/鏈霉素、DMEM/F12、胰酶等均購買于Gibco，佛波酯（Phorbol 12?myristate 13?acetate，PMA，Abmole）用于誘導THP?1 細胞轉化為巨噬細胞，氯化鈷（CoCl2，Sigma）用于誘導細胞缺氧。RNA 提取試劑盒購買于奕杉生物，Evo M?MLV 反轉錄試劑和SYBR Green Pro Taq HS 購買于艾科瑞生物。兔抗人單克隆抗體CD86（Biosis，1∶300），鼠抗人單克隆抗體CD206（Santa Cruz Biotechnology，1∶400），兔抗人單克隆抗體HIF?1α（Cell Signaling Technology，1∶300），DyLight 488 山羊抗鼠和DyLight 594 山羊抗兔熒光二抗（Cell Signaling Technology，1∶500），鼠/兔通用二抗試劑、DAB 顯色試劑、過氧化物酶封閉液等購買于廣州葆利公司。

1.3 免疫組織化學染色 將標本經10%福爾馬林固定，石蠟包埋后切成4 μm 厚的切片。65 ℃烤片2 h 后，依次經二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水，再經檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復。修復后PBS清洗3 次，使用內源性過氧化物酶封閉液封閉10 min。PBS 清洗后，使用10%山羊血清封閉1 h，甩干后滴加抗HIF?1α 一抗工作液，4℃孵育過夜。第二天室溫下復溫半小時，PBS 漂洗三次，滴加生物素標記羊抗兔/鼠二抗工作液孵育10 min，PBS 漂洗3 次后，DAB顯色液顯色1～3 min，最后經自來水沖洗、蘇木素復染、梯度乙醇脫水等步驟，使用中性樹脂封片，封片后在顯微鏡下觀察。免疫組織化學染色強度評估如下：染色強度評分：無染色（評分0）、弱但可檢測（評分1）、強（評分2）、非常強（評分3）；染色區域評分：評分0（無陽性細胞），評分1（1%～25%陽性細胞），評分2（26%～50%陽性細胞），評分3（50% ～ 75%陽性細胞），評分4（75% ～ 100%陽性細胞）。通過將兩個分數相加計算總的染色評分。

1.4 雙重免疫熒光實驗 石蠟標本依次經65 ℃烤片2 h，二甲苯和無水乙醇脫蠟水化，山羊血清封閉后，滴加預先混合的抗CD86、CD206 一抗工作液，4℃孵育過夜。第二天PBS 清洗三次，室溫下孵育熒光二抗2 h，繼而滴加DAPI 孵育5 min，使用防熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 THP?1培養和處理 THP?1細胞使用RIMP?1640（含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素，50 μmol/L β?巰基乙醇）培養，當細胞密度達到80% ～ 90%進行傳代種板。將細胞離心，進行細胞計數，以每孔1 × 106個細胞的密度接種到6 孔板中，加入100 ng/mL 的PMA 處理24 h，誘導單核細胞分化為巨噬細胞。24 h 后，棄去上清液，缺氧組加入含有50 ng/mL CoCl2的細胞培養基進行缺氧處理，常氧組加入等量PBS 作為對照。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real?time fluo?rescence quantitativepolymerase chain reaction，RT?qPCR） 收集缺氧和常氧處理后的巨噬細胞，按照RNA 提取試劑盒的說明提取RNA。采用Ta?kara 體系將提取的RNA 逆轉錄為cDNA。RT?qP?CR 的模板為cDNA，嚴格參照Takara 體系配置反應體系，熒光定量熱循環條件為：95 ℃，2 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，循環40 次。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 統計學方法 使用SPSS 21.0 對數據進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以進行描述，兩獨立組間采用獨立樣本t檢驗，非正態分布的資料采用非參數檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜異位癥和正常子宮內膜組織中巨噬細胞的分布情況 采用雙重免疫熒光技術檢測異位病灶和正常子宮內膜組織中巨噬細胞的分布情況，M1 型巨噬細胞的標記物為CD86（綠色熒光），M2 型巨噬細胞的標記物為CD206（紅色熒光），細胞核通過DAPI 染色（藍色熒光）。異位病灶中M1型巨噬細胞密度為（3.87 ± 3.67）個/視野，M2 型巨噬細胞的密度為（24.96±19.76）個/視野，總的巨噬細胞密度為（28.83 ± 21.20）個/視野；正常子宮內膜中M1 型巨噬細胞密度為（0.76 ± 1.00）個/視野，M2 型巨噬細胞的密度為（8.79±7.99）個/視野，總的巨噬細胞密度為（9.55 ± 8.76）個/視野。異位病灶中的巨噬細胞密度大于正常子宮內膜，且以M2型巨噬細胞為主，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 正常子宮內膜和子宮內膜異位癥中巨噬細胞的分布情況（400×）Fig.1 Distribution of macrophages in normal endometrium and endometriosis（400×）

2.2 子宮內膜異位癥病灶和正常子宮內膜組織中HIF?1α 表達情況 免疫組織化學檢測子宮內膜異位癥病灶和正常子宮內膜組織中HIF?1α 的表達情況，結果見圖2。內異癥腺體細胞的HIF?1α 表達水平顯著高于非內異癥患者子宮內膜的腺體細胞［染色強度：（6.31±0.62）分vs.（4.89±2.07）分，P＜0.05，圖2E］。內異癥間質細胞的HIF?1α 表達水平顯著高于非內異癥患者子宮內膜的間質細胞［染色強度：（5.76 ± 1.00）分vs.（3.93 ± 2.35）分，P＜0.05，圖2F］。提示子宮內膜異位癥病灶中缺氧更嚴重，且腺上皮細胞的缺氧程度高于子宮內膜間質細胞。

圖2 正常子宮內膜和子宮內膜異位癥中HIF?1α 的表達情況（200×和400×）Fig.2 Expression of HIF?1α in normal endometrium and endometriosis（200×and 400×）

2.3 缺氧通過HIF?1α 誘導巨噬細胞向M2 型極化 為探究缺氧條件下巨噬細胞的表型轉變情況，使用PMA 將THP?1 細胞誘導為巨噬細胞后，使用50 ng/mL CoCl2誘導巨噬細胞缺氧，檢測巨噬細胞的極化情況。結果顯示HIF?1α 的表達升高，M1型標記物IFN?γ、CD86、TNF?α 的表達水平無變化或變化無統計學意義，M2型標記物CD206，CD163、Arg?1、TGF?β 表達升高，巨噬細胞表現為M2 型巨噬細胞。結果提示缺氧誘導HIF?1α 表達上調，誘導巨噬細胞轉變為M2 型，分泌抗炎細胞因子。

3 討論

本研究采用雙重免疫熒光的方法檢測了子宮內膜異位癥病灶中巨噬細胞的分布情況，結果顯示病灶內的巨噬細胞數量增多，以M2 型為主。免疫組化實驗揭示異位病灶內HIF?1α 的表達升高，腺體中HIF?1α 的表達高于間質細胞，表明異位病灶內存在更嚴重的缺氧狀況。進一步的細胞實驗表明缺氧可以誘導巨噬細胞表達HIF?1α，促進其轉變為M2 型巨噬細胞。由此推測，HIF?1α 可能是誘導巨噬細胞表型轉變的重要轉錄因子。

巨噬細胞是固有免疫系統的重要組成部分，由單核細胞分化而來，具有提呈抗原、分泌細胞因子、非特異性免疫防御監視等功能，是介導內異癥免疫失衡的重要細胞。在不同的刺激因素下，巨噬細胞可以向不同的方向極化，分化為經典激活型（M1 型）或者替代激活型（M2 型）巨噬細胞。M1型巨噬細胞可以被IFN?γ、TNF?α、LPS 等激活，產生大量促炎性細胞因子IL?1β、TNF?α、IL?6、NO、ROS 等，發揮促炎作用。相反，M2 型巨噬細胞可以被IL?4、IL?10、IL?13 等激活，釋放抗炎因子、生長因子和修復因子等，參與組織修復、血管生成、免疫抑制等過程，以抗炎作用為主［11］。本研究結果顯示內異癥患者異位病灶內的M1、M2 型巨噬細胞的數量都顯著高于正常子宮內膜組織，以M2型巨噬細胞為主，表明M2 型巨噬細胞可能是在子宮內膜異位癥發生發展過程中起重要作用的細胞，針對M2 型巨噬細胞的靶向治療有助于改善內異癥的相關癥狀。

但是子宮內膜異位癥病灶中的巨噬細胞的表型是動態變化的，隨著病變的進展不斷發生變化的。研究者采用子宮內膜異位癥小鼠模型，在不同的時間段檢測病灶內浸潤性巨噬細胞的表型。結果顯示，在第4 天病變發展早期，巨噬細胞主要表達促炎標記物iNOS 和主要組織相容性復合體Ⅱ（MHC II），但在第7 天后，表達精氨酸酶1 和CD204 的巨噬細胞比例逐漸增高，證明病灶內的巨噬細胞從促炎型M1 巨噬細胞活性過渡到抗炎型M2 巨噬細胞，這種表型的漸進性轉變進一步證明M2 型巨噬細胞在子宮內膜異位癥樣病變發展中起核心作用［12］。本研究中心收集的子宮內膜異位癥病例多數因疼痛、不孕等于本中心就診，并進行手術治療，多數患者病程長，故而病灶浸潤的巨噬細胞主要為M2 型巨噬細胞，M1 型巨噬細胞數量較少。

圖3 缺氧處理誘導巨噬細胞轉變為M2 型巨噬細胞Fig.3 Hypoxia treatment induces the transformation of macrophages into M2 macrophages

不同表型的巨噬細胞參與內異癥發生發展的不同時期，而M2 型巨噬細胞作為內異癥發展過程中占主導的免疫細胞，被視為促進內異癥發生發展的關鍵免疫細胞。研究者通過耗竭子宮內膜異位癥小鼠體內的巨噬細胞，繼而注射不同表型的巨噬細胞，觀察病變的進展。結果發現M0 型巨噬細胞不影響病變數目或重量沒有影響，但轉移M1型巨噬細胞可減少病變重量。相反，轉移M2 型巨噬細胞會導致病變重量增加，證明了M2 型巨噬細胞可能對病變的生長和發展起重要作用，而M1 型巨噬細胞具有拮抗作用，可以清除異位內膜組織，破壞病變結構。同時研究也表明M2 型巨噬細胞參與子宮內膜異位癥的血管生成過程，耗竭子宮內膜異位癥小鼠模型M2 型巨噬細胞，可以降低VEGFA 和TGF?β 等促血管生成因子的水平，降低病灶的血管生成，導致病灶的總重量減少［5］。并且，減少M2 巨噬細胞的病變浸潤可以顯著減少病變的纖維化含量，而巨噬細胞耗竭后系統性過繼轉移M2a 型巨噬細胞（M2 型巨噬細胞的一種亞型），病灶的纖維化程度增加［13］。本研究發現誘導巨噬細胞轉變為抗炎型后，TGF?β、Arg?1 和IL?10等蛋白質mRNA 水平表達增加，研究已經證實這些蛋白質是巨噬細胞參與組織修復、重塑過程的重要生物學分子，而且M2 型巨噬細胞相關的分子標記物CD206、CD163 等可能是內異癥的潛在診斷和判斷預后的一種方式［14-15］。

目前研究者推測，內異癥中巨噬細胞的表型轉變可能受到內異癥發生發展中微環境變化的調控［12］。與正常在位子宮內膜相比，缺氧是子宮內膜異位癥的重要組成和重要特征，是脫落的子宮內膜進入盆腹腔必須面臨的微環境改變，可能參與子宮內膜異位癥中巨噬細胞功能和表型轉變的調控。在腫瘤學領域，缺氧對于巨噬細胞功能的影響是研究的熱點。缺氧微環境可以通過上調CCL2、CCL5、M?CSF等趨化因子誘導巨噬細胞進入缺氧區域HIF?1α 通過促進CCL2 分泌招募單核細胞/巨噬細胞［16-17］，繼而下調CCR2、CCR5 等趨化因子受體將其阻滯在缺氧區域，并且缺氧區域的巨噬細胞主要為M2 型巨噬細胞［18］。缺氧區域的巨噬細胞表現出更強的促腫瘤生長、增殖、遷移的能力，促血管生成的能力，免疫抑制以及化療抵抗的能力［19-20］。

缺氧誘導因子是在缺氧環境中發揮作用的重要調控因子，是由HIF?1α 和HIF?1β 組成的異二聚體。HIF?1β 在常氧和缺氧的情況下可穩定存在，而HIF?1α 只有在缺氧條件下能穩定存在，這種特性讓HIF?1α 成為缺氧條件下最重要的缺氧調節因子。缺氧對于巨噬細胞的調控作用很可能是通過HIF?1α 實現的。在胃癌組織中，已有研究證明HIF?1α 可以誘導巨噬細胞轉變為M2 型，進一步在細胞轉錄組水平的測序表明缺氧可以上調HIF?1α表達，促進巨噬細胞表達抗炎相關因子升高，巨噬細胞表現為抗炎型［21-22］。而且激活HIF?1α 可以抑制巨噬細胞NF?κB 的激活和隨后促炎細胞因子的產生，特異性抑制脂多糖刺激的巨噬細胞分化為M1 細胞［23］。本研究顯示子宮內膜異位癥病灶存在更嚴重的缺氧，腺體的缺氧程度高于間質。進一步在細胞水平，發現缺氧通過上調HIF?1α，誘導巨噬細胞的M1 型標記物TNF?α、CD86、IFN?γ 表達，M2 型標記物Arg?1、TGF?β、CD206、CD163 等表達升高。以上結果證明在子宮內膜異位癥中，缺氧微環境也可以通過上調HIF?1α 促進巨噬細胞向抗炎型巨噬細胞轉化。

巨噬細胞表型是通過綜合比較多種細胞因子和表面標記物的表達而確定，與其他研究一樣，在組織實驗水平，檢測異位病灶中巨噬細胞表型的標記物數量有限，使得很難真正定義內異癥中復雜的巨噬細胞表型，雖然此研究使用的分子標記物CD86、CD206分別為目前公認且廣泛使用的M1、M2型巨噬細胞標記物。為展示不同時期內異癥病灶中巨噬細胞的組成和探索巨噬細胞表型的動態轉變，應該收集不同分期的臨床標本進行研究，但本研究使用的組織標本缺乏早期病灶，研究不夠全面。

綜上所述，子宮內膜異位癥異位病灶中巨噬細胞密度顯著增加，而且以M2 型為主。HIF?1α 是缺氧誘導巨噬細胞轉變為M2 型的重要調控因子。如何改善異位病灶的缺氧微環境，調控巨噬細胞的極化狀態，可能為挖掘新的治療靶點提供新的思路。