PCL電紡納米纖維膜的制備及其力學性能和生物相容性的研究*

高智華，趙勁民

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，南寧 530021）

靜電紡絲分為普通電紡和熔融電紡，是一種簡單而高效的制造工藝。其中普通電紡具有可控性強、操作簡便的優(yōu)點，制得的納米纖維膜不僅直徑小、纖維分布均勻，更重要的是比表面積大、孔隙率高，在組織工程、固定化酶催化、傷口敷料、超細濾膜和防護織物等領域得到廣泛應用[1-2]。研究表明，靜電紡絲納米纖維的直徑大小對細胞的黏附和增殖具有重要影響。在大尺寸、微米級尺寸和納米級尺寸的纖維支架中，細胞分別主要分布在孔洞之中、單根纖維上以及多根纖維之間，不同直徑大小的纖維對細胞生長具有促進作用。例如，微米級和納米級纖維可以促進成骨細胞、成纖維細胞的增殖，而后者對平滑肌細胞、成纖維細胞和軟骨細胞等影響不大[3-4]。

聚己內酯（PCL）經(jīng)由美國食品和藥物管理局（FDA）批準認證，在組織工程領域中是最常用的高分子材料之一，具有良好的生物相容性和生物降解性。目前缺乏對不同濃度PCL 在不同紡絲電壓和距離的條件下所制備的納米纖維膜的性能對比研究。有文獻報道，以材料濃度、紡絲電壓、紡絲距離為參考變量對納米纖維膜的形態(tài)結構、力學性能和生物活性作了較深研究[5-6]。通過改變紡絲電壓和紡絲距離，制備出了不同濃度的PCL 納米纖維膜，利用掃描電鏡和力學儀器分析對比，探討不同參數(shù)對靜電紡絲膜的微觀形態(tài)、直徑大小和力學性能的影響；此外，將乳兔的骨髓間充質干細胞（BMSCs）培養(yǎng)于電紡納米纖維膜表面，觀察細胞生長狀況。本實驗為PCL 納米纖維膜在骨軟骨缺損修復組織工程領域的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 出生3 d 的新西蘭白兔1 只，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。PCL 購自西格瑪奧德里奇公司（中國上海）；六氟異丙醇購自麥克林公司（中國長沙）；α-低糖培養(yǎng)基（α-DMEM）購自Gibco 公司（美國）；胎牛血清購自VWR 公司（澳大利亞）；青－鏈霉素、胰蛋白酶和PBS 緩沖液均購自索萊寶公司（中國北京）；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）購自Dojindo 公司（日本）；Calcein-AM/PI染色試劑盒購自Invitrogen公司（美國）。

1.2 主要儀器 靜電紡絲機購自能環(huán)新材料科技有限公司（中國蘇州）；磁力攪拌器購自KEW-LAB公司（澳大利亞）；力學測試儀購自NSTRON 公司（美國）；電子精密天平購自TOLEDO 公司（瑞士）；全波長酶標儀購自Thermo Fisher公司（澳大利亞）；細胞恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司（美國）；超凈工作臺購自海爾公司（中國青島）；倒置相差顯微鏡購自OLYMPUS 公司（日本）；掃描電子顯微鏡購自VEGA3LMU 公司（美國）；真空干燥箱購自龍伍機械有限公司（中國南京）；超聲波清洗機購自新芝生物科技股份有限公司（中國寧波）。

1.3 納米纖維膜的制備與分組 用電子精密天平準確稱取不同重量的PCL 顆粒，溶于5 mL 六氟異丙醇溶液中，配制6%PCL、8%PCL、10%PCL 3 種不同濃度的紡絲前溶液，超聲15 min 混勻，磁力攪拌器攪拌，超聲30 min混勻。通過靜電紡絲機制備出3 組納米纖維膜，分別為6%PCL 組、8%PCL 組、10%PCL組。

研究不同紡絲電壓時，選定8%PCL電紡溶液，將紡絲電壓設置為5 kV、15 kV、25 kV，其他參數(shù)不變，制備3組納米纖維膜，分別為8%PCL+5 kV組、8%PCL+15 kV組、8%PCL+25 kV組。

將紡絲距離設置為10 cm、15 cm和20 cm，其他參數(shù)不變，制備3 組納米纖維膜，分別為8% PCL+10 cm組、8%PCL+15 cm組、8%PCL+20 cm組。

對照組為不放置任何納米纖維膜。進行靜電紡絲時，嚴格控制溫度和濕度。將納米纖維膜放置在真空干燥箱中干燥24 h后備用。

1.4 靜電紡絲PCL 納米纖維膜形態(tài)結構和機械性能的檢測 將不同參數(shù)下獲得的PCL 電紡納米纖維膜裁剪為10 mm×10 mm的矩形，噴金后干燥2 h，置于掃描電鏡（SEM）下觀察其形態(tài)結構和直徑，每個樣本重復3 次，同一樣本選擇3 種不同倍數(shù)的視野進行觀察。

打開力學測定儀，將每種電紡納米纖維膜裁剪為20 mm×20 mm 的矩形，每個樣本準備5 個待用。首先用游標卡尺測量膜的厚度并輸入儀器電腦軟件，設置初始距離為1 cm，拉伸速率為6 mm/min，調整好角度，測量拉伸應力、拉伸應變和楊氏模量。

1.5 兔BMSCs 的提取和培養(yǎng) 取出生3 d 的新西蘭白兔，剃毛，注射3%戊巴比妥鈉麻醉，浸泡在75%酒精中滅菌，在相對無菌條件下剪下乳兔的四肢，去除皮膚和部分肌肉，放在含5%青－鏈霉素的PBS緩沖液中，蓋好培養(yǎng)皿，轉移到超凈臺。用PBS 反復清洗，無菌紗布將肌肉組織剔除，同時剪去兩端的軟骨，最后利用注射器沖出骨髓。將含有BMSCs的培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，每3 d換1次培養(yǎng)液。待細胞長滿后將其取出，轉移到超凈臺中吸去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化5 min，再加入2 mL 培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉移到離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞備用。

1.6 CCK-8 檢測細胞活性 裁剪不同參數(shù)下制備的PCL電紡納米纖維膜，輕輕放置在24 孔板中，上面放置銅環(huán)壓住（已高壓消毒）防止膜上浮，巴氏管吸取適量75%酒精到孔板中浸泡6 h，在通風的紫外燈櫥下滅菌12 h。將兔BMSCs 以3×105的密度種于24 孔板中，3 d 后取出孔板，吸去培養(yǎng)液，PBS 清洗3次，避光加入25 μL CCK-8 和250 μL培養(yǎng)液，孵育2 h。用全波長酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度（OD）值。

1.7 活死細胞檢測 將兔BMSCs 培養(yǎng)在不同參數(shù)下制備的納米纖維膜上3 d，PBS清洗3次，按照Calcein-AM PI 活死細胞雙染試劑盒說明書，避光加入活死細胞染色液，孵育25 min后吸去染色液。熒光顯微鏡下隨機選擇5 個視野，觀察活細胞（呈綠色）的數(shù)量，拍照。用Image J 軟件計算活細胞所占面積。活細胞所占面積=活細胞總數(shù)面積/拍照視野面積×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紡絲材料濃度對纖維結構形態(tài)的影響 當PCL濃度為6%時，電鏡下觀察到纖維表面出現(xiàn)較多的串珠，纖維分布雜亂，當PCL 濃度為8%和10%時，串珠消失，纖維均勻分布，見圖1。當紡絲電壓為15 kV或紡絲距離為15 cm時，納米纖維的直徑最小，分布均勻，孔隙率較大，見圖2、圖3。

圖1 不同材料濃度的PCL 電紡納米纖維膜的SEM圖

圖2 不同施加電壓的PCL 電紡納米纖維膜的SEM圖

圖3 不同接收距離的PCL 電紡納米纖維膜的SEM圖

2.2 不同溶液濃度、施加電壓和接收距離對纖維膜機械性能的影響 當濃度為變量時，與6%PCL 組和10%PCL 組比較，8%PCL 組的拉伸應力和楊氏模量提高；當紡絲電壓為變量時，與8%PCL+5 kV組和8%PCL+25 kV組比較，8%PCL+15 kV組的拉伸應力和楊氏模量提高；當紡絲距離為變量時，與8% PCL+10 cm 組和8% PCL+20 cm 組比較，8%PCL+15 cm組的拉伸應力和楊氏模量提高，見圖4。

圖4 不同溶液濃度、施加電壓和接收距離對纖維膜機械性能的影響

2.3 不同溶液濃度、施加電壓和接收距離對負載兔BMSCs 納米纖維膜細胞活性的影響 與對照組比較，8% PCL 組、8% PCL+15 kV 組、8% PCL+15 cm組細胞增殖活性和活細胞所占面積升高最明顯（均P＜0.05）；不同濃度、不同施加電壓和不同接收距離的PCL納米纖維膜均可促進細胞黏附、生長且培養(yǎng)于膜上的細胞活性均優(yōu)于對照組（均P＜0.05），見圖5、圖6。

圖5 負載兔BMSCs的不同參數(shù)的PCL電紡納米纖維膜的CCK-8檢測結果

圖6 負載兔BMSCs 的不同參數(shù)的PCL 電紡納米纖維膜的活死細胞染色結果

3 討論

本研究探討了靜電紡絲過程中不同工藝參數(shù)對PCL納米纖維膜結構形態(tài)和細胞活性的影響，結果表明，不同的溶液濃度、紡絲電壓、紡絲距離對納米纖維膜的微觀形態(tài)結構和力學性能以及生物相容性均有影響。

實驗表明，當紡絲濃度較小時，紡絲前溶液的黏度也相對較小，致使聚合物分子鏈之間纏結機會較少，在纖維表面形成串珠。逐漸加大紡絲濃度可以改善納米纖維的形態(tài)[7]。當濃度相同時，隨著電壓升高，納米纖維膜的力學性能及細胞活性先升高后降低（P＜0.05）。這是因為，隨著電壓升高，電場強度也隨之升高，對噴射出的溶液牽拉作用增強，導致納米纖維直徑減小，此時，納米纖維膜的孔隙率較高，更有利于細胞生長，同時，納米纖維之間接觸點增多，提高了纖維膜的力學性能[8]。當電壓強度過高時，射流迅速到達接收板上，沒有得到充分地牽拉，此時，纖維直徑增大，纖維膜的力學性能和生物活性均下降[9-10]。在同一濃度下，隨著紡絲距離的增加，納米纖維膜的機械性能及細胞活性先升高后降低（P＜0.05）。這是因為當紡絲距離較小時，電場強度較大，對噴射出的溶液牽拉作用較強，當作用時間較短，因牽拉不充分導致纖維直徑較大；隨著紡絲距離增加，電場強度略微減小，同時牽拉作用時間延長，此時射流牽拉充分因而纖維直徑減小，納米纖維膜的孔隙率較高，更有利于細胞生長，同時，納米纖維之間接觸點增多，提高了纖維膜的力學性能。當接收距離過大時，電場強度微弱，即使有較長的作用時間，射流也無法得到充分地牽拉，導致纖維直徑增大，纖維膜的力學性能和生物活性均下降[11]。

綜上所述，不同的紡絲濃度、紡絲電壓、紡絲距離可以改變PCL納米纖維膜的微觀結構、力學性能和生物相容性。