BUB1B在肺鱗狀細胞癌中的表達及其意義*

丁彤彤，王君萍，李祖云

（廣西醫科大學第一臨床醫學院病理科，南寧 530021）

肺癌是全球范圍內發病人數和死亡人數最多的癌癥之一[1]。肺鱗狀細胞癌（LUSC）作為肺癌最常見的病理類型之一，因其獨特的臨床病理表現和基因突變特征，預后較差且目前的靶向藥物對LUSC 患者治療效果不佳[2-3]，因此尋找研究新的靶向目標是非常有價值的。BUB1有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸激酶B（BUB1B）是紡錘體裝配檢查點蛋白家族的成員之一。紡錘體裝配檢查點（SAC），也稱為有絲分裂檢查點，主要作用是在有絲分裂和減數分裂過程中，通過延遲細胞分裂直至確保正確的染色體分離來維持基因組的穩定性[4]。BUB1B已經被證明與多種癌癥的發生和進展相關，如FOXM1/BUB1B信號通路的激活與橫紋肌肉瘤[5]及膠質母細胞瘤[6]的發生有關。BUB1B的過表達有助于前列腺癌的進展[4]。BUB1B 通過激活mTORC1信號通路促進肝細胞癌進展[7]，也可以通過JNK/c-Jun 通路促進肝外膽管癌進展[8]。BUB1B 的表達促進肺腺癌的進展[9]。BUB1B在腎透明細胞癌中顯著高表達，可作為腎透明細胞癌新的預后生物標志物和免疫治療靶點[10]。但在LUSC 中尚未見關于BUB1B 及相關機制的報道。本研究擬通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）、免疫組化技術（immunohistochemistry，IHC）及公共數據庫數據綜合分析BUB1B 在LUSC發生發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 LUSC中BUB1B表達數據的收集

從TCGA（The Cancer Genome Atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/）獲取LUSC 和癌旁組織BUB1BmRNA 的表達數據，包括502 例LUSC 和49 例非癌對照的基因表達數據。從GEO 數據庫（Gene Expression Omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）獲取LUSC 相關高通量數據，共納入22 個數據集（GSE1987、GSE2088、GSE3268、GSE4824、GSE6044、GSE8569、GSE11117、GSE11969、GSE19188、GSE21933、GSE27489、GSE29249、GSE30219、GSE31446、GSE32036、GSE33479、GSE40275、GSE62113、GSE74706、GSE84784、GSE103512、GSE67061）包括455 例LUSC 樣本和379 例非癌樣本。對所有原始表達數據進行標準化，所有表達數據均經log2轉化。

1.2 細胞株

人LUSC 細胞（NCI-H2170）和人正常肺上皮細胞（BEAS-2B）均購自上海中喬新舟生物技術有限公司；H2170 培養環境為含12%FBS 及1%雙抗的1640培養基，37℃，5%CO2；BEAS-2B培養環境為含1%上皮細胞生長因子及1%雙抗的支氣管上皮細胞專用培養基，37℃，5%CO2。

1.3 RT-qPCR檢測ENSR00000075512 和BUB1B mRNA的表達情況

采用離心柱式總RNA提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）提取細胞總RNA，Prime-ScriptTM RT 試劑盒（Takara）進行逆轉錄合成cDNA，使用PowerUp SYBR Master Mix（Thermo）進行RT-qPCR。所有實驗操作步驟均嚴格按照試劑說明書進行。引物序列如下，ENSR00000075512上游：5’-GAGGCAGGAGAATCGCTTGAACC-3’，下游：5’-GAGATGGAGTCTTGCTCTTGTCACC-3’；BUB1B上游：5’-ATGGGTCCTTCTGGAAACTTAG-3’，下游：5’-GGAATGTAGTGTCAAAAACCCC-3’；GAPDH上游：5’-CCAACCGCGAGAAGATGACC-3’，下游：5’-GAGTCCATCACGATGCCAGT-3’。BUB1B及ENSR00000075512引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設計和合成，GAPDH引物序列由捷尼斯生物科技有限公司設計和合成。最后采用2-△△CT方法分析mRNA的相對表達量。

1.4 IHC檢測BUB1B的蛋白表達情況

1.4.1 標本及相關病理學資料收集 LUSC組織以及癌旁組織均來源于廣西醫科大學第一附屬醫院2019年4月至2021年6月經病理科確診的LUSC患者穿刺或手術切除標本的石蠟包埋組織，所有患者均簽署了知情同意書。病例納入標準：（1）根據《原發性肺癌診療規范（2018 年版）》的標準，初次確診為原發性LUSC的患者；（2）患者在就診前未接受放療或化療等其他形式的輔助治療；（3）LUSC是患者發現的第一個原發腫瘤，非轉移性腫瘤。排除標準：（1）無詳細臨床病理參數的患者；（2）在存檔的石蠟標本中，LUSC 組織太小而不能再次進行切片的患者。收集相關臨床資料，包括年齡、性別、臨床分期、原發腫瘤大小、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況、腫瘤分化程度、有無吸煙史等參數。

1.4.2 免疫組化實驗主要試劑和方法 制作厚度4 μm的石蠟切片，75 ℃烘烤2 h，使用二甲苯及梯度酒精脫蠟，EDTA 抗原修復3 min，采用通用二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）阻斷內源性過氧化物酶，重組Anti-BubR1 抗體（購自abcam 抗體官方網站），按1∶100 稀釋，37 ℃濕盒中孵育90 min，順序滴加通用二步法檢測試劑盒中的反應增強液和增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，均在室溫下濕盒中孵育20 min，DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）顯色，蘇木精復染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4.3 染色結果評估 根據染色強度和陽性細胞百分率對切片進行評分分級：（1）染色強度：沒有著色0分，淺著色1分，中等著色2分，強著色3分；（2）陽性細胞百分率：0～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3 分；76%～100%為4 分；兩者乘積：0～1 分為陰性；2～4 分為弱陽性；5～8 分為中等陽性；9～12 分為強陽性。本文界定“0～8 分”為BUB1B蛋白為低表達，“9～12分”為高表達。

1.5 從數據庫中查詢在LUSC 中與BUB1B 表達相關eRNA

使用enhancer RNA in cancers（eRic）數據庫（https://hanlab.uth.edu/eRic）查詢在LUSC中與BUB1B表達相關增強子RNA（eRNA），及eRNA 在LUSC組織和正常肺組織中的表達數據。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組均數比較采用t檢驗。計數資料用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用STATA 12.0 計算綜合的總標準化均數差（SMD）并繪制森林圖和集成ROC（summary ROC，sROC）曲線。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基于數據庫的BUB1B mRNA差異表達

合并GEO 芯片數據與TCGA 序列數據進行meta分析，結果表明：BUB1B在LUSC組織中的mRNA表達水平高于正常組織（SMD=2.37；95%CI：1.72～3.03；I2=91.9%）（圖1A）；sROC 曲線下面積（AUC）為0.98（95%CI：0.97～0.99）（圖1B），提示BUB1BmRNA 的高表達具有良好的區分LUSC 和正常肺組織樣本的能力。BUB1B的合并的敏感性為0.94（圖2A），合并的特異性為0.92（圖2B），合并的陽性似然比（PLR）為9.67（圖2C），合并的陰性似然比（NLR）為0.11（圖2D）和合并的診斷優勢比（DOR）為90.65（圖2E）。以上結果均顯示BUB1B在LUSC中表達上調。

圖1 TCGA序列數據和GEO芯片數據綜合分析BUB1B mRNA表達情況

圖2 集成所有數據集的診斷價值

2.2 RT-qPCR結果

檢測LUSC細胞株H2170及人正常肺上皮細胞系BEAS-2B中BUB1B的表達。結果顯示，LUSC細胞中BUB1BmRNA 表達水平高于正常肺上皮細胞（t=-5.883，P=0.004），見圖3。

圖3 BUB1B在LUSC細胞株H2170和人正常肺上皮細胞系BEAS-2B中的表達

2.3 HIC實驗結果

總共收集61 例LUSC 組織和對應54 例癌旁或正常肺組織，HIC 染色鏡下觀見圖4 A～圖4 D。BUB1B蛋白在LUSC組織細胞中定位于細胞質，在細胞質呈棕黃色陽性表達。LUSC 組織中BUB1B蛋白染色評分分級為陰性0 例，弱陽性者23 例，中等陽性者20例，強陽性者18例，而癌旁/正常肺組織中BUB1B 蛋白染色評分分級為陰性48 例，弱陽性者6 例，中等陽性者0 例，強陽性者0 例，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 BUB1B蛋白染色評分分級與樣本組織類型之間的關系n（%）

圖4 LUSC組織和癌旁或正常肺組織IHC染色結果（×400）

2.4 BUB1B 蛋白表達水平與LUSC 患者臨床病理特征之間的關系

分析BUB1B 表達水平與LUSC 患者不同的臨床病理特征之間的相關性，結果顯示，BUB1B 蛋白在原發腫瘤大小、臨床分期中的表達差異具有統計學意義（P＜0.05），在性別、年齡、淋巴結轉移、遠處轉移、分化程度、吸煙史中的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 BUB1B 蛋白表達水平與LUSC 患者臨床病理特征之間的關系

2.5 BUB1B在LUSC中的潛在調節途徑

在eRic 數據庫中查找在LUSC 組織中與BUB1B表達相關的eRNA，得到ENSR00000075512（15：40395501-40401501），基于eRic 數據庫數據，ENSR00000075512在LUSC 中表達高于非癌組織（P＜0.01），且在不同亞型中的差異表達具有統計學意義（P＜0.01）（圖5）。RT-qPCR檢測ENSR00000075512在LUSC 細胞株H2170 及人正常肺上皮細胞系BEAS-2B中的表達（圖6），結果顯示，LUSC細胞中ENSR00000075512表達水平高于正常肺上皮細胞（t=-7.427，P=0.002），提示BUB1B和ENSR 00000075512可能通過相互作用參與LUSC發生發展。

圖5 基于eRic 數據庫ENSR00000075512在LUSC組織中表達

圖6 ENSR00000075512在LUSC細胞株H2170和人正常肺上皮細胞系BEAS-2B中的表達

3 討論

BUB1B 作為SAC 蛋白家族成員，在SAC 信號傳導和著絲點與紡錘體微管的穩定附著中起著核心作用[8]。在多種癌癥中的高表達以及促癌作用已經有多篇文獻報道[4-10]，Shin 等[11]和Park 等[12]也發現BUB1B 的低表達參與了結腸腺癌的發生和進展。由于癌癥的發展機制十分復雜，涉及的分子機制非常多，BUB1B 在不同癌癥中調節機制也不盡相同，如FoxM1 通過調節BUB1B 影響橫紋肌肉瘤[5]和膠質母細胞瘤[6]的生物學行為；在肝外膽管癌中，JNKc-Jun 信號通路可能被BUB1B 調控[12]；Qiu 等[7]的研究發現BUB1B在肝細胞癌中通過上調mTORC1 信號通路發揮致癌作用。目前尚無BUB1B 在LUSC中的差異表達及潛在分子機制的系統研究。

本研究通過對包含基因芯片和RNA 測序等的數據綜合分析，同時結合RT-qPCR、IHC進一步驗證BUB1B 在LUSC 中的表達情況，結果表明，BUB1B在LUSC 組織中的表達水平高于非癌組織；RTqPCR 結果顯示，BUB1B在LUSC 細胞株H2170 中的表達高于肺正常上皮細胞系，IHC 實驗證實LUSC 組織BUB1B 蛋白表達水平高于癌旁或正常肺組織，且BUB1B蛋白在原發腫瘤大小、臨床分期中的表達差異具有統計學意義。上述結果提示，BUB1BmRNA 的高表達具有良好的區分LUSC 和正常肺組織樣本的功能。

增強子是一類增強靶基因轉錄活性的DNA 順式作用元件，可以不依賴距離和方向，通過形成染色體環來促進基因啟動子的正確激活[13]。eRNA是從增強子轉錄的一種非編碼RNA[14]。過去很長一段時間人們普遍認為eRNA 只是轉錄的副產物，但隨著近些年對eRNA 的深入研究，eRNA 的許多功能已經被證明在乳腺癌[14-18]、膀胱癌[19-21]、T細胞急性淋巴細胞白血病[22]、頭頸鱗癌[23-24]、肝細胞癌[25-28]等多種癌癥中發揮作用。Zhang等[15]通過整合大規模患者樣本和癌細胞系的多組學和藥物基因組學數據，鑒定了相當數量的臨床相關eRNA，建立了一個數據門戶網站，即eRic，為研究eRNA 的表達情況、靶基因及其在腫瘤發生中的功能提供了全面的支持。通過eRic數據庫，筆者得到與BUB1B表達相關的增強子ENSR00000075512，RT-qPCR 結果顯示，ENSR00000075512在LUSC細胞株H2170中的表達高于肺正常上皮細胞系。以上結果提示在LUSC中ENSR00000075512和BUB1B可能存在調控關系并起到促癌作用。但二者具體如何對LUSC細胞起調控作用，尚有待通過體外、體內實驗等其它實驗方法進行進一步的研究。

綜上所述，BUB1B在LUSC 組織中表達上調，可能促進LUSC的發生發展，BUB1BmRNA 的高表達具有良好的區分LUSC 和正常肺組織樣本的功能，是一個具有潛在應用前景的預后生物標志物。后續研究將進一步探討BUB1B 促進LUSC 發生發展的分子機制，有望為LUSC 的靶向治療提供新的靶點和理論依據。