高靈敏液相色譜—質譜聯用方法用于HIV-1感染細胞中胞苷修飾全分析*

鄭瑞麗，周歐路，褚潔梅△，安三奇，蔣俊俊，葉 力，梁 浩△

（1.廣西醫科大學生命科學研究院 廣西醫科大學再生醫學與醫用生物資源開發應用省部共建協同創新中心，南寧 530021；2.廣西醫科大學公共衛生醫學院 廣西艾滋病防治研究重點實驗室，南寧 530021；3.玉林市第一人民醫院，玉林 537000）

DNA甲基化為真核生物中普遍的修飾方式，包括5-甲基胞苷（5-mdC）以及通過TET家族蛋白逐步催化氧化形成5-羥甲基胞苷（5-hmdC）、5-醛基胞苷（5-fdC）和5-羧基胞苷（5-cadC）[2-4]。5-fdC和5-cadC會被DNA 胸腺嘧啶糖苷酶識別并割斷糖苷鍵去除堿基形成AP 位點，再通過堿基切除修復途徑將正常未修飾的胞嘧啶填補到AP 位點，實現主動去甲基化的過程。DNA 甲基化和去甲基化的動態平衡與癌癥、急性淋巴細胞白血病和阿爾茲海默癥等多種疾病的發生、發展密切相關[5-6]。然而目前關于DNA甲基化與HIV的研究鮮有報道。

液相色譜—質譜聯用（LC-MS）被廣泛用于化合物的定性和定量[7]，是檢測修飾核苷的主流方法[8]。然而由于5-fdC和5-cadC修飾含量極低，現有方法并不能直接在HIV-1 感染細胞內同時檢測到4 種胞苷修飾，需通過一些前處理方法來提高LCMS 檢測靈敏度[9]。本研究旨在建立一種同時檢測胞苷修飾的化學標記結合LC-MS 的高靈敏分析方法，在LC-MS分析前采用2-溴-1-4-二乙氨基苯基乙酮（BDEPE）標記4 種胞苷修飾（5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC），并用此方法分析HIV-1感染前、后的細胞DNA中4種胞苷修飾，為進一步研究胞苷修飾在艾滋病中的作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和試劑

人類T 淋巴細胞系MT2 細胞由美國馬薩諸塞大學醫學院盧山教授惠贈。HIV-1 ⅢB由中國人民解放軍軍事醫學科學院提供。BDEPE 購自阿法埃莎（中國）化學有限公司；S1 核酸酶和牛小腸堿性磷酸酶購自Takara 生物技術公司；核酸外切酶I 購自美國Sigma 公司；1640 培養基和胎牛血清購自美國Gibco 公司；質譜級甲醇、質譜級乙腈（ACN）、三乙胺（TEA）、脫氧胸苷（dT）、5-mdC、5-hmdC均購自上海麥克林生化科技有限公司；甲酸（FA）購自賽默飛世爾科技有限公司（中國）；氯仿購自天津市富宇精細化工有限公司；脫氧胞苷（dC）、脫氧鳥苷（dG）、脫氧腺苷（dA）均購自梯希愛化成工業發展有限公司（上海）；5-fdC、5-cadC購自Berry&Associates。

1.2 分析方法的建立

提取待測樣本的基因組DNA 酶解為單個核苷混合物，標記試劑BDEPE 與5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC發生特異性反應，最后使用LC-MS系統對標記產物進行分析，見圖1。

圖1 化學標記結合LC-MS檢測DNA中4種胞苷修飾的分析方法流程圖

1.2.1 溶液配制 核苷標準品分別用蒸餾水制備為1 mg/mL 的母液，化學標記試劑BDEPE 用ACN配備為1 mg/mL 的母液，TEA 原液用ACN 稀釋100倍（濃度為80 nmol/μL），均置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 化學標記條件優化 設置一系列不同的BDEPE濃度、催化劑TEA用量、反應溫度和反應時間。優化化學標記的反應條件，所有反應的總體系為200 μL，5-mdC標準核苷作為代表，標記后產物使用LC-MS檢測分析。

1.2.3 標準曲線樣本制備和處理 不同濃度的核苷標準品分別進行BDEPE標記，反應體系包括核苷標準品、2 mmol/L BDEPE、4 mmol/L TEA 和82 μL ACN，在60 ℃條件下孵育6 h，反應終止后用氮氣吹干，加入2 μL ACN和38 μL蒸餾水復溶后用LC-MS進行分析。繪制標準曲線，取3次測定的平均值。

1.2.4 DNA 樣本制備和處理 使用TRIzol 試劑提取細胞DNA，將DNA 酶解成核苷，向DNA 樣本中加入1 μL 的10×S1 核酸酶緩沖液，95 ℃水浴5 min后，迅速放到冰上2 min，再加入0.5 μL S1 核酸酶，37 ℃水浴2 h；然后加入4 μL 10×堿性磷酸酶緩沖溶液，1 μL 蛇毒磷酸二酯酶I，0.3 μL 堿性磷酸酶及24.7 μL 蒸餾水，37 ℃水浴2 h。然后氯仿抽提得到核苷。用氮氣吹干后采用已優化的條件進行標記反應并上機檢測。

在課堂上構建和諧的師生關系一直以來都是課堂改革的重要方向之一。而和諧的師生關系必須是建立在平等、溝通和交流的基礎之上的。而傳統課堂上，師生之間的地位是不平等的，教師的地位被提到了學生難以企及的高度之上，師道尊嚴的課堂教學讓學生更多的是懼怕。地位差距的懸殊令學生難以主動地和教師展開有效的交流和溝通，從而影響到課堂上和諧的師生關系的形成。而生活化的課堂教學中，學生的主體地位得到了應有的尊重，這對于和諧的課堂氛圍的形成大有裨益。在良好的課堂氛圍中，對于師生之間和諧的關系的形成具有促進作用。

1.2.5 LC-MS 分析 采用美國Waters 公司液質聯用系統，色譜柱為Waters C18 column（150 mm×2.1 mm，5 μm，Waters，USA），柱溫箱溫度40 ℃，流速0.2 mL/min，流動相A 為甲酸水，流動相B 為ACN，流動相梯度為：0～3 min，95%A；3～10 min：95%～15% A；10～11 min，15% A；10～11 min，15%～95%A；12～17 min，95%A。定性分析采用高分辨液質聯用儀（Waters G2-XS qTOF），正離子全掃模式下監測質量范圍為100～800 m/z。定量分析采用低分辨液質聯用儀（Waters G2-XS QqQ），正離子多反應監測模式，監測離子對分別為：5-mdC-BDEPE（413.2183→297.1710）、5-hmdC-BDEPE（429.2132→313.1659）、5-fdC-BDEPE（427.1976→311.1659）、5-cadC-BDEPE（632.3079 →516.2605）、A（268.2 →136.1）、U（245.1→113.1）、C（244.1→112.1）、G（284.1→152.1）。MassLynx V4.1 軟件執行數據采集和分析。

1.3 方法應用

利用所建立的化學標記結合LC-MS 方法對MT2 細胞DNA 中的胞苷修飾水平進行定性、定量檢測。MT2 細胞與HIV-1 ⅢB 病毒（105TCID50）共培養3 d 后收集樣本，按照DNA 樣本制備和處理方法進行處理，BDEPE標記后用LC-MS系統分析。

1.4 統計學方法

采用Origin 2021 軟件和Chembiodraw 18.0 軟件作圖，SPSS 13.0 和Graphpad Prism 8.0 進行統計分析。用Studentt檢驗進行組間比較，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 標記反應條件的優化

BDEPE濃度1～2 mmol/L、TEA濃度2～6 mmol/L、反應溫度60 ℃、反應時間6 h時，標記產物（5-mdC-BDEPE）的峰面積最大，見圖2。因此，最佳反應條件為2 mmol/L BDEPE 和4 mmol/L TEA 在60 ℃條件下反應6 h。

圖2 標記反應條件優化

2.2 液相條件優化

本研究分析流動相A 中加入兩種不同濃度的酸對目標物質譜響應和色譜分離的影響，分別為0.05%、0.1%甲酸水溶液和0.05%、0.1%乙酸水溶液，流動相B選用ACN。在水相中加入0.1%的甲酸檢測響應最高，效果最好，見圖3。因此，LC-MS 分析采用0.1%的甲酸水溶液作為流動相A。

圖3 胞苷修飾標記產物流動相A優化色譜圖

2.3 方法評價

2.3.1 標記轉化率和標記產物穩定性 通過對比衍生化試劑BDEPE與5-mdC、5-hmdC和5-fdC反應前、后反應底物的含量來計算衍生化反應的轉化率，5-mdC、5-hmdC、5-fdC、5-cadC 修飾的轉化率分別為99.8%、100%、93.7%、91.2%，均高于90%。標記產物在反應后48 h內穩定，見圖4。

圖4 5-mdC標記產物穩定性分析

2.3.2 細胞樣品中目標物定性分析 細胞樣品中的目標分析物通過與理論值的精確分子量和標準品的保留時間對比來進行定性分析。經過BDEPE標記后的細胞內5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC的精確分子量與理論值的誤差在可接受范圍內，見表1。細胞樣品中4種標記后目標分析物與標準品標記產物的保留時間一致，見圖5。由此可以確定在細胞樣品中檢測到了4種胞苷修飾。

圖5 細胞樣品與標準品的保留時間對比

表1 目標分析物理論分子量與標準品和細胞樣品的實測分子量

2.3.3 方法靈敏度 使用LC-MS 方法直接檢測時（即標記前）僅能檢測到HIV-1 感染細胞DNA 中含量較高的5-mdC 和5-hmdC，檢測不到痕量5-fdC 和5-cadC。在經過BDEPE 標記后，出峰時間明顯延長，有助于色譜分離，且質譜響應提高，成功在HIV-1感染細胞DNA中同時檢測到5-mdC、5-hmdC、5-fdC和5-cadC，見圖6。

圖6 細胞樣品目標分析物標記前、后對比

5-mdC、5-hmdC、5-fodC 和5-cadC 標記前最低檢測限（LODs）分別為5.20 fmol、2.81 fmol、9.43 fmol 和13.82 fmol，標記后LODs 降低，分別為0.09 fmol、0.08 fmol、0.18 fmol 和0.15 fmol，化學標記結合LC-MS與直接檢測相比，檢測5-mdC、5-hmdC、5-fodC和5-cadC的靈敏度分別提高了58倍、35倍、52倍和92倍。

2.3.4 目標物定量標準曲線 對7個不同濃度的標準品進行檢測（1 次/d，連續3 d），計算得到標準曲線。在標準曲線范圍內，5-mdC、5-hmdC、5-fdC 和5-cadC 均具有良好的線性，相關系數（R2）均大于0.99，見表2，平行重復的相對標準偏差（RSD）低于20%。

表2 目標分析物的標準曲線

2.4 方法應用

使用所建立的化學標記結合LC-MS 檢測方法對HIV-1 感染人類T 淋巴細胞系MT2 細胞DNA 中5-mdC、5-hmdC、5-fdC 和5-cadC 修飾進行分析。5-mdC、5-hmdC、5-fdC、5-cadC在未感染HIV-1病毒細胞（對照組）中的含量分別為（3.42±0.26）/102dG、（10.03±2.94）/105dG、（3.21±0.18）/107dG、（0.56±0.005）/107dG，在HIV-1 感染組中的含量分別為（7.76±1.31）/102dG、（15.24±3.37）/105dG、（8.09±0.36）/107dG、（2.2±0.007）/107dG，HIV-1 感染組15-mdC、5-fdC和5-cadC含量高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

本研究通過使用化學標記與LC-MS方法結合，進一步提高對目標分析物的檢測靈敏度。選擇BDEPE作為化學標記試劑，其含有溴乙酮基與胞苷修飾反應，同時包含苯環和二甲叔胺基團，有助于提高標記產物的色譜分離和質譜離子化，將目標分析物的檢測靈敏度提高了35～92 倍。標記后產物使用LC-MS方法檢測，實現了在HIV-1病毒感染細胞中5-mdC、5-hmdC、5-fdC 和5-cadC 這4 種胞苷修飾的全分析。這4 種修飾共同參與維持DNA 胞嘧啶甲基化修飾的動態平衡，在多種生理過程中具有調控作用[10-12]，檢測這些修飾的水平是研究其生物學影響的第一步，尤其是對痕量修飾（5-fdC 和5-cadC）的準確定量。在本研究中，標記試劑BDEPE顯著改善了目標分析物的液相色譜分離，并提高了這幾種痕量修飾的檢測靈敏度，特異性也由于BDEPE的加入而得到提高，使得在HIV-1感染細胞中DNA 上的4 種胞苷修飾能準確定性、定量分析。該方法靈敏度高、特異性強，并且可以推廣用于其他樣本中胞苷修飾的全分析。

本課題組通過使用該方法，首次成功對HIV-1感染的人類T 淋巴細胞系MT2 細胞的基因組DNA中4 種胞苷5-mdC、5-hmdC、5-fdC 和5-cadC 含量進行同時檢測，結果顯示，與未感染HIV-1病毒細胞相比，感染HIV-1 病毒的細胞5-mdC、5-fdC 和5-cadC含量升高。5-mdC、5-fdC和5-cadC在HIV-1感染機體后異常增高說明這3種胞苷修飾可能在HIV感染中發揮一定的作用，值得更進一步深入研究。同時，胞苷修飾增多可能是HIV-1 感染機體后的一般特征，或可作為HIV-1感染的潛在生物標志物。

本研究開發了一種靈敏度高、特異性強的化學標記結合LC-MS 同時測定DNA 中4 種胞苷修飾的檢測方法。應用該方法檢測HIV-1 感染細胞前、后這4 種胞苷修飾的含量變化，發現5-mdC、5-fdC 和5-cadC 在HIV-1 感染后顯著升高，這為將來進一步探索胞苷甲基化與HIV-1感染之間的關系打下研究基礎，對分析胞苷修飾在HIV感染中的作用具有重要意義。