荔仁總皂苷抗鴨乙型肝炎病毒感染的實(shí)驗(yàn)性研究*

蘇惠萍，韋朋海，覃 彬，黃斯梅，蒙明慮，熊國(guó)林，謝志春

（廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室，南寧 530021）

荔枝盛產(chǎn)于我國(guó)廣東、福建和廣西南部，是我國(guó)南方地區(qū)的主要水果之一，其果肉、葉、核、皮均具有一定的藥用價(jià)值[1]。荔仁（Litchi Semen）為無患子科植物荔枝Litchi chinensisSonn.的干燥成熟種子，表皮為紫棕色或棕紅色，呈圓形或長(zhǎng)圓形，形似卵，表面光滑略有凹陷或細(xì)波紋，味微甘、苦、澀，性溫，歸肝腎經(jīng)，是我國(guó)藥典收載的中藥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，荔仁在抗腫瘤、降血糖、抗氧化以及改善學(xué)習(xí)記憶等方面均有一定的效果[2-3]。劉瑩等[4]發(fā)現(xiàn)荔仁活性成分對(duì)肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤具有廣泛的抑制作用。Zhao等[5]用荔仁含藥血清作用于肝癌HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制肝癌血管的生成。此外，蔣蔚峰等[6]用荔仁總皂苷進(jìn)行了抗HBV的體外實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)荔仁總皂苷的抗乙肝病毒作用與拉米夫定相近，不僅能夠抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg及HBeAg 的表達(dá)，還能控制HBV-DNA 的復(fù)制。本研究擬通過感染乙肝病毒的麻鴨作為動(dòng)物模型，對(duì)荔仁總皂苷抗乙肝病毒作用作進(jìn)一步驗(yàn)證，為開發(fā)治療病毒性乙型肝炎新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1 日齡廣西麻鴨，體重40～50 g，雌雄均可，購(gòu)于廣西南寧市飼料獸藥禽苗公司，飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，定時(shí)給食，自由飲水，室溫（25±5）℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h 光照晝夜循環(huán)。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 病毒血清

收集本地成年廣西麻鴨的血液，將分離得到血清經(jīng)普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）和瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)證實(shí)為陽(yáng)性病毒血清，存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)用藥

實(shí)驗(yàn)所用荔仁購(gòu)于南寧市景昌中藥飲片有限公司，產(chǎn)地為廣西。將曬干后的荔仁粉碎，取荔仁碎顆粒3 kg，加入濃度為50%乙醇回流濃縮，再用石油醚對(duì)濃縮后的濾液萃取2 次、水飽和正丁醇溶液純化5次，得到荔仁總皂苷粉末193.42 g（即1 g荔仁總皂苷相當(dāng)于15.51 g生藥）。經(jīng)香草醛－冰醋酸－高氯酸比色法測(cè)定其皂苷純度約為49.06%。阿昔洛韋（aciclovir，ACV），購(gòu)自湖南迪諾制藥有限公司，規(guī)格：0.1 g/片，批號(hào)：140230。

1.4 主要試劑及儀器

HBsAg 和HBeAg 檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒均購(gòu)自上海執(zhí)誠(chéng)生物科技股份有限公司。MyCycler 型梯度PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；GelDoc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；7100型日立全自動(dòng)生化分析儀，日本日立公司；CFX96?Real-Time PCR Detection System，美國(guó)Bio-Rad 公司；Multiskan GO 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)讀數(shù)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.5 造模、分組及給藥

將1 日齡麻鴨適應(yīng)性飼養(yǎng)12 h，觀察麻鴨飲食和精神狀態(tài)無異常后，向每只鴨子腹腔注射含陽(yáng)性鴨乙肝病毒血清0.2 mL，觀察1 周后經(jīng)右側(cè)頸靜脈采血0.5 mL并分離血清，用普通PCR法篩選出呈陽(yáng)性感染的麻鴨60 只，常規(guī)飼養(yǎng)至13 日齡作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。將60 只鴨乙型肝炎病毒DNA（duck hepatitis B virus DNA，DHBV-DNA）呈陽(yáng)性的麻鴨按隨機(jī)數(shù)字表法分為5 組，每組12 只：荔仁總皂苷高、中、低劑量組（分別為640 mg/kg、320 mg/kg、160 mg/kg）、ACV 陽(yáng)性對(duì)照組（ACV 組）（200 mg/kg）和模型對(duì)照組。每天定時(shí)經(jīng)灌胃給藥1次，連續(xù)給藥14 d。模型對(duì)照組每天給予每只鴨子2 mL 蒸餾水，ACV 組每天給予每只鴨子200 mg/kg 的ACV溶液。

1.6 采血和取肝組織標(biāo)本

在給藥前（T0）、給藥后7 d（T7）、14 d（T14）和停藥后5 d（P5）從鴨右頸靜脈取血1.5 mL，室溫靜置1 h，分離得到血清樣本，存于-80 ℃冰箱中待檢。停藥5 d后將鴨子處死，剖腹摘取肝臟，取肝右葉中部1 cm×1 cm×1 cm肝組織，用10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)蘇木精－伊紅（HE）染色后光鏡下觀察病理組織學(xué)形態(tài)。

1.7 乙肝病毒學(xué)及肝臟轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)

1.7.1 DHBV-DNA 檢測(cè) 在1.5 mL 離心管中加入量為1:5 的裂解液和麻鴨血清，水浴鍋煮沸10 min后取出降至室溫，再經(jīng)10 000 r/min 離心15 min 后分層，吸其上清液即為DNA 提取液。將DNA 提取液采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）的方法檢測(cè)鴨乙肝病毒載量。

1.7.2 鴨乙肝表面抗原（DHBsAg）和鴨乙肝病毒e抗原（DHBeAg）檢測(cè) 使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），按試劑盒說明書的方法檢測(cè)血清樣本中DHBsAg和DHBeAg OD值。

1.7.3 ALT和AST檢測(cè) 按試劑盒說明書操作，用7100 型日立全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)麻鴨血清樣本中ALT和AST活性。

1.8 肝組織病理切片觀察

將所有鴨肝組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)肝臟炎性病變的不同類型以及病變所占范圍。參考我國(guó)《病毒性肝炎防治方案》及國(guó)際常用的METAVIR、Ishak和Scheuer計(jì)分系統(tǒng)[7]，對(duì)麻鴨肝臟組織標(biāo)本病變范圍的估計(jì)主要分為4個(gè)級(jí)別：（1）無病變；（2）輕度病變（即病變占整個(gè)視野的范圍≤1/3）；（3）中度病變（1/3＜病變占整個(gè)視野的范圍≤2/3）；（4）重度病變（即病變占整個(gè)視野的范圍＞2/3）。統(tǒng)計(jì)各組麻鴨肝臟組織病變程度的分布情況，并將整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件、R 4.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 9.3.0 軟件進(jìn)行繪圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。滿足球形檢驗(yàn)要求的多次測(cè)量資料，可用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，不滿足要求則用多元方差分析。計(jì)量資料同一組內(nèi)均值的兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)及擴(kuò)展t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥前、后各組DHBV-DNA載量變化情況

與同組T0相比，荔仁總皂苷3個(gè)劑量組在T7、T14及P5均呈現(xiàn)抑制病毒活性的效果并存在良好的量效關(guān)系（P＜0.01），其中高劑量組的效果最佳。P5時(shí)各組DHBV-DNA 均有回升現(xiàn)象，但ACV 組的DHBV-DNA 回升現(xiàn)象比荔仁總皂苷高劑量組明顯，說明高劑量荔仁總皂苷能更穩(wěn)定地抑制病毒反彈。見表1。

表1 各組給藥前、后不同時(shí)間點(diǎn)DHBV-DNA載量的變化情況拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，n=12，

表1 各組給藥前、后不同時(shí)間點(diǎn)DHBV-DNA載量的變化情況拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，n=12，

與同組T0比較，a)P＜0.01，b)P＜0.05。

2.2 給藥前、后各組DHBsAg 和DHBeAg OD 值的變化情況

不同組中不同時(shí)間點(diǎn)的DHBsAg 和DHBeAg OD 值均未有明顯變化，同一組中DHBsAg 和DHBeAg OD 值在給藥前、后相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組給藥前、后不同時(shí)間點(diǎn)DHBsAg和DHBeAg OD值變化

2.3 給藥前、后各組ALT和AST活性變化情況

與同組T0相比，在T14時(shí)荔仁總皂苷高劑量組對(duì)ALT活性表現(xiàn)出抑制效果（P＜0.05）。ACV 組和荔仁總皂苷高劑量組在T7、T14及P5均有降低AST活性的作用（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組給藥前、后不同時(shí)間點(diǎn)ALT和AST活性變化

2.4 肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果

感染DHBV后，麻鴨肝組織病變類型最主要的病變類型為胞漿疏松化、肝匯管區(qū)炎癥和肝細(xì)胞氣球樣變，依次占比為80%（48/60）、72%（43/60）和42%（25/60）；其余為嗜酸性變和點(diǎn)灶狀壞死，見圖3和表2。Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同治療組的鴨乙型肝炎療效比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.038，P＜0.01）。擴(kuò)展t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較結(jié)果顯示，ACV組、荔仁總皂苷高、中劑量組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.624、3.210、3.171，均P＜0.01），前3 組以輕度病變?yōu)橹鳎囟炔∽償?shù)量少甚至無，而模型對(duì)照組重度病變數(shù)量較多。另外，荔仁總皂苷低劑量組的病變程度與模型對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖3 麻鴨肝臟組織的不同病變類型分布（HE染色）

表2 各組麻鴨肝臟病理改變類型及數(shù)量n=12

表3 各組麻鴨肝臟病變程度數(shù)量統(tǒng)計(jì)n=12

3 討論

鴨乙型肝炎動(dòng)物模型是抗乙肝病毒中藥篩選中最為經(jīng)濟(jì)、方便及高效的模型[8-9]，本實(shí)驗(yàn)利用該模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)荔仁總皂苷抗鴨乙肝病毒的作用，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗病毒效果和護(hù)肝作用。在實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組麻鴨血清中的DHBV-DNA 水平無大幅度波動(dòng)，陽(yáng)性對(duì)照藥物ACV可顯著抑制血清DHBV-DNA，表明模型的建立和使用比較理想[10-11]。給藥治療后，荔仁總皂苷能顯著抑制HBV的復(fù)制并且不會(huì)出現(xiàn)停藥后顯著病毒反跳，體現(xiàn)了其在抗HBV治療方面的優(yōu)勢(shì)，作用機(jī)制可能與抑制體內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的復(fù)制有關(guān)。

然而荔仁總皂苷3個(gè)劑量組均未表現(xiàn)出有明顯的抑制DHBV 分泌DHBsAg 和DHBeAg 的作用。分析其原因可能有：（1）給藥劑量太低未達(dá)到有效血藥濃度，荔仁總皂苷在前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中已表現(xiàn)出對(duì)DHBsAg 和DHBeAg 表達(dá)的抑制作用，且抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)、劑量的增加隨之增強(qiáng)[6]；（2）給藥時(shí)間可能太短，因不同藥物的作用機(jī)制不同，藥物起效所需時(shí)間也存在不同；（3）荔仁總皂苷在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中沒有抑制DHBsAg和DHBeAg表達(dá)的效果。

國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道，荔仁能明顯降低小鼠急性酒精肝損傷模型[12]、四氯化碳肝損傷模型和硫代乙酰胺肝損傷模型[13]血清中AST 及ALT 含量。本研究中荔仁總皂苷高劑量組在給藥后及停藥后5 d均能夠降低AST活性，在給藥后14 d后才出現(xiàn)降低ALT活性的作用，可能與AST、ALT 出現(xiàn)的順序有關(guān)。肝臟病理檢查顯示大部分麻鴨肝臟主要存在胞漿疏松化和肝臟匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)這兩種病變類型，未觀察到大片肝細(xì)胞壞死病灶，區(qū)別于人類乙型肝炎中常見的匯管區(qū)炎癥和點(diǎn)灶狀壞死病變，提示鴨HBV 與人類HBV 在某些方面可能存在不同之處[14-15]。用藥治療后，與模型對(duì)照組相比較，ACV組與荔仁總皂苷高、中劑量組均能有效減少由DHBV引起的重度肝臟炎性病變。

綜上所述，荔仁總皂苷在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有較好的抗乙肝病毒以及改善肝臟病理學(xué)的作用，抑制病毒反彈效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物ACV，且能降低AST活性。但其抑制DHBsAg 和DHBeAg 分泌作用不明顯。此外，荔仁總皂苷在抗病毒機(jī)制、護(hù)肝降酶作用機(jī)制以及抗纖維化等方面還有待進(jìn)一步研究，以此為開發(fā)應(yīng)用荔仁總皂苷提供更多的理論依據(jù)。