組蛋白去乙酰化酶9在香煙煙霧暴露所致肺氣腫小鼠中的作用*

謝 婷，鄭桂賢，霍增榆，韋鑫燕，黃顏冰，陳小麗，白 晶

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，南寧 530021）

肺氣腫是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）主要的病理特征，是COPD 發(fā)病機(jī)制的研究重點(diǎn)，通過建立肺氣腫動物模型是眾多學(xué)者研究COPD 公認(rèn)的有效方法[1]。吸煙是肺氣腫發(fā)展主要的危險(xiǎn)因素，香煙煙霧中含有焦油、尼古丁、氫氰酸等多種有害成分，這些有害物質(zhì)可直接作用于呼吸道，長期吸煙可導(dǎo)致肺內(nèi)異常炎癥反應(yīng)，損害支氣管和肺泡上皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺功能下降，從而使肺氣腫發(fā)病率增加。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）參與控制免疫與炎癥反應(yīng)，在自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病中起重要作用[2]，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）是控制Treg 細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵因子。有研究表明，組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能相關(guān)，HDAC9在此過程中起關(guān)鍵作用[3]。本研究構(gòu)建HDAC9 基因缺失小鼠與野生型小鼠肺氣腫模型，觀察HDAC9 在香煙煙霧暴露所致肺氣腫小鼠中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器 HDAC9-/-C57BL/6 小鼠與野生型小鼠，鼠齡6 周，雄性，體重（20±2）g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物使用許可證號：SYXK（滬）2017-0012。真龍牌香煙（武漢煙草公司，焦油量10 mg，煙堿量1.0 mg）。CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit、分選柱（Miltenyi，德國）；Foxp3 抗體（Novus，美國）；Percp-Cy5.5-anti-mouse-CD4 及PE-anti-mouse-CD25 (BD Pharmingen,美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量擴(kuò)增試劑盒（Takara公司，日本）。BX51正置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；BD FACSVerse 流式細(xì)胞儀（BD Pharmingen,美國）；Applied Biosystems 7500 型熒光定量PCR儀（ABI，美國）。

1.2 動物模型建立 自制兩個(gè)玻璃艙，分別標(biāo)為A、B 兩艙，將野生型煙熏組與HDAC9-/-煙熏組置于A 艙中進(jìn)行香煙煙霧暴露建立肺氣腫模型，每次同時(shí)點(diǎn)燃5只香煙，40 min后開艙通氣20 min，每天重復(fù)4次，每周煙熏5 d，連續(xù)24 周。將野生型對照組與HDAC9-/-對照組置于B 艙中呼吸新鮮空氣，其余飼養(yǎng)條件完全同煙熏組。

1.3 肺組織病理學(xué)觀察 用10%甲醛固定左肺，石蠟包埋后進(jìn)行切片及HE染色。顯微鏡下（×200）觀察每張切片肺部情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野并拍照。

1.4 免疫磁珠分選脾臟中Treg 細(xì)胞 取小鼠脾臟于200目濾網(wǎng)中研磨成后離心5 min，棄上清后加入紅細(xì)胞裂解液，離心洗滌獲得單個(gè)核細(xì)胞。依次加入適量的Biotin-Antibody cocktail、Anti-Biotin MicroBeads、CD25-PE antibody、Anti-PE MicroBeads，經(jīng)LD 柱陰選和MS 柱陽選后得到CD4+CD25+Treg細(xì)胞，使用CD4及CD25流式抗體進(jìn)行染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，該類細(xì)胞純度達(dá)90%以上。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測小鼠肺組織Foxp3 蛋白的表達(dá) 左肺石蠟切片，脫蠟后免疫組化染色。陽性表達(dá)呈棕黃色，F(xiàn)oxp3 表達(dá)在胞核或胞質(zhì)中。顯微鏡下（×200）觀察每張切片，隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用Image-Pro plus 軟件分析積分光密度（integrated optical density，IOD）比值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)（RT-qPCR）法檢測Treg 細(xì)胞中HDAC9mRNA 表達(dá)及肺組織中IL-1βmRNA 表達(dá) Trizol 法提取總RNA，先逆轉(zhuǎn)錄，隨后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。以β-Actin為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列如下，β-Actin上游：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’；HDA-C9上游：5’-TGCATCGGAAGCCTGCATAA-3’，下游：5’-CGTATTCACGGACTGGTGGAGA-3’；IL-1β上游：5’-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游：5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織病理學(xué)變化 顯微鏡下可見野生型對照組與HDAC9-/-對照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤；野生型煙熏組氣道壁和肺泡間隔可見炎細(xì)胞增多，肺泡壁斷裂明顯，肺泡腔擴(kuò)大；HDAC9-/-煙熏組肺泡間隔部分?jǐn)嗔?，但較野生型煙熏組減輕，未見明顯炎細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化（HE，×200）

2.2 Treg 細(xì)胞純度的檢測及小鼠Treg 細(xì)胞中HDAC9mRNA的表達(dá)情況 免疫磁珠分選小鼠脾臟的CD4+CD25+Treg 細(xì)胞，純度達(dá)90%以上。RTqPCR結(jié)果顯示：與野生型對照組比較，野生型煙熏組Treg 細(xì)胞中HDAC9的mRNA相對表達(dá)量增高（P＜0.01）。見圖2和圖3。

圖2 CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度檢測

圖3 Treg細(xì)胞中HDAC9 mRNA表達(dá)水平

2.3 各組小鼠肺組織Foxp3 蛋白的表達(dá)情況 陽性表達(dá)呈棕黃色。與野生型對照組比較，野生型煙熏組肺組織中Foxp3 表達(dá)減少，HDAC9-/-對照組Foxp3 表達(dá)增多（均P＜0.01）；與HDAC9-/-對照組比較，HDAC9-/-煙熏組Foxp3表達(dá)減少（P＜0.01）；與野生型煙熏組比較，HDAC9-/-煙熏組Foxp3 表達(dá)增多（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織Foxp3蛋白表達(dá)比較

2.4 各組小鼠肺組織IL-1βmRNA的表達(dá)情況 與野生型對照組比較，野生型煙熏組肺組織中IL-1βmRNA的表達(dá)量增高（P＜0.01）；與野生型煙熏組比較，HDAC9-/-煙熏組肺組織中IL-1βmRNA的相對表達(dá)量降低（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織IL-1β mRNA的表達(dá)情況

3 討論

香煙煙霧是肺氣腫的主要危險(xiǎn)因素，本實(shí)驗(yàn)以長期香煙煙霧暴露建立小鼠肺氣腫模型，顯微鏡下觀察小鼠小氣道和肺部病理表現(xiàn)，煙熏組肺組織中可見氣道壁和肺泡間隔炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁斷裂明顯，相鄰肺泡融合，肺泡腔擴(kuò)大，表現(xiàn)出明顯的肺氣腫改變。白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）屬于白細(xì)胞介素-1 家族，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌，可招募炎癥細(xì)胞至感染部位,引發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷。有研究報(bào)道，與非吸煙者比較，肺氣腫患者肺組織和痰中IL-1β水平顯著升高，提示IL-1β參與氣道炎癥和肺氣腫的進(jìn)展[4]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類控制體內(nèi)免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，在維持天然免疫耐受和調(diào)控自身免疫性疾病中起重要作用。Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在控制天然Tregs 的發(fā)育和功能中起關(guān)鍵作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，肺氣腫患者肺組織內(nèi)Treg 細(xì)胞數(shù)量減少，且Foxp3 的顯著減少[6]。此外，有研究報(bào)道，與不吸煙者相比，肺氣腫患者的肺泡灌洗液中出現(xiàn)Treg 細(xì)胞數(shù)量下調(diào)[7]。Isajevs 等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，與不吸煙健康人和吸煙肺功能正常人相比較，肺氣腫患者小氣道中Foxp3 表達(dá)減少。大量的研究提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與肺氣腫的發(fā)生發(fā)展。

組蛋白乙酰化和去乙酰化在調(diào)控真核細(xì)胞基因表達(dá)中起重要作用，參與調(diào)節(jié)慢性炎癥性肺病[9]。本課題組前期研究表明HDACs 參與介導(dǎo)肺氣腫中Treg細(xì)胞免疫抑制功能，進(jìn)一步在肺氣腫的發(fā)生發(fā)展中起作用[10]。盡管Treg 細(xì)胞表達(dá)多種HDAC，但研究表明HDAC9 在Treg 細(xì)胞功能和發(fā)育中尤為重要[11]。有研究報(bào)道，與野生型小鼠相比，HDAC9基因敲除小鼠體內(nèi)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量增加和抑制功能增強(qiáng)[12]。本課題組的研究也表明在香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠肺氣腫模型中Treg 細(xì)胞功能失調(diào)可能與Treg細(xì)胞中HDAC9表達(dá)增多有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，HDAC9-/-煙熏組肺組織中Foxp3 的表達(dá)量增多，而IL-1β 炎癥介質(zhì)表達(dá)減少，肺泡間隔部分?jǐn)嗔眩螝饽[改變較野生型煙熏組減輕。結(jié)果提示在HDAC9-/-煙熏組肺組織中，F(xiàn)oxp3+Treg 細(xì)胞增多可能進(jìn)一步參與肺氣腫改善。因此，本課題組推斷敲除HDAC9可增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和功能，參與介導(dǎo)香煙煙霧暴露所致的肺氣腫情況改善，為其治療提供一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。